资讯动态

简述细胞培养一般步骤(细胞培养的步骤以及注意事项)

2022-06-14 10:25:43
|
访问量:114802

  细胞培养是细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究的基础实验技术之一。通过细胞培养可以直接观察活细胞的形态结构和生命活动,联合各种技术进行各种物理、化学生物的研究。

简述细胞培养一般步骤

  一、 复苏

  1. 把冻存管从液氮中取出来,立即投入37℃水浴锅中,轻微摇动。液体都融化后(大概1-1.5分钟),拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

  2. 把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍,把粘在壁上的细胞都洗下来),1000转离心5分钟。

  3. 把上清液倒掉,加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中后左右轻轻摇动,使培养皿中的细胞均匀分布。

  4. 标好细胞种类和日期、培养人名字等,放到CO2培养箱中培养,细胞贴壁后换培养基。

  5. 3天换一次培养基。

  二、 传代

  1. 培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

  2. 把原有培养基吸掉。

  3. 加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行),消化1-2分钟。

  4. 细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。

  5. 用移液枪吹打细胞,把细胞都悬浮起来。

  6. 把细胞吸到15ml的离心管中,1000转离心5分钟。

  7. 倒掉上清液,加1-2ml培养基,把细胞都吹起来。

  8. 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般,癌细胞分5个,正常细胞传3个。继续培养。

  三、 冻存把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来,分装到灭菌的冻存管中,静止几分钟,写明细胞种类,冻存日期。4℃  30min,-20℃ 30min,-80℃过夜,然后放到液氮灌中保存。 冻存液的配制: 70%的培养基+20%FBS+10%DMSO.  DMSO要慢慢滴加,边滴边摇。

细胞培养的注意事项

  首先是准备各种溶液。

  第一是配制溶液过程中要用到的水。水用纯水,高压灭菌之后,再去内毒素。去内毒素方法很多,最简单可以放在烘箱180度3小时。或者过去内毒素的柱子后,高压灭菌。

  第二,各种溶液灭菌:抗生素用去内毒素水配制后,直接过滤除菌(过0.22u滤头)。可以用一次性无菌注射器过一次性0.22u滤头。

  现在用的培养液,如果是商业化液体培养基,不用处理。如果是粉末,需要用去内毒素水在生物安全柜(或超净工作台)进行配制,再过滤除菌。可以先配浓缩液(如10×),过滤除菌后。再用灭菌去内毒素水稀释成1×培养液。

  第三,完全培养液的配制:培养液加上合适比例的血清即可。但血清一般保存于-20℃,一般解冻是放在4℃冰箱解冻,耗时长,而且必须解决完全之后,才能进行完全培养基的配制。

  所以要提前几个小时就将血清从-20℃转入4℃,以期完全解冻。当然如果这一次就需要用完的话(是指用这些血清配制的培养液都用完),也可以放到37℃解冻。

  第四,最重要的是保证过程中无菌。液体必须要分装。无论过程中用到的培养液、胰酶、血清、PBS、生理盐水、抗生素尽量分装。分装是为了防止污染。如果操作有误,仅能威胁到其中一支,而非整个。培养液、血清、PBS、生理盐水分装为20mL、50mL或100mL/管。胰酶、抗生素可分装为1mL/管。分装最好先于细胞操作

  第五,操作之前,培养液先放到37度的细胞培养箱里复温。原因:尽量减少对细胞的刺激。低温对于细胞也是一个刺激因素。

  第六,操作之前,大脑先过一遍此次操作所需要用到的所有用具。将所有用具先放到无菌台面上。减少拿入拿出的动作,保证无菌。(如果万一发现少拿了什么,也不要紧,再加上就是。如果是枪头盒、移液管等用具,最好先用消毒酒精喷一下)。

  第七,操作之前,带着的手套先喷消毒酒精。然后再进入工作台。等一分钟,等手套上的酒精挥发之后再进行操作。

  • 业务咨询

    业务咨询专线:133 7682 0615

    Email:lxyjy@wie-biotech.com

在线留言(即刻联系为您提供专业的解决方案) ×