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细胞实验:关于细胞凋亡检测实验(方法及原理)

2021-09-16 03:32:01
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  这次分享的内容是关于细胞凋亡检测实验技术,详细的内容如下:

  实验方法原理:

  本实验用1μg/ml 三尖杉酯碱HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。

  三尖杉酯碱(HT)是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。

  细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着色,凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质,可跨膜进入活细胞,因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱,它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合(主要结合于A-T)碱基区),显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。

  实验材料:人早幼粒白血病HL-60细胞

  试剂、试剂盒:

  三尖杉酯碱、Tris-Hcl、EDTA缓冲液、碱性裂解液、SDS、醋酸钠、异丙醇、乙醇、溴酚蓝、蔗糖指示剂、TBE电泳缓冲液、琼脂糖、溴乙锭、PI母液、Ho33342母液

  仪器、耗材:

  荧光显微镜、电泳仪、电泳槽、微量加样器、离心管、载玻片、盖玻片

细胞凋亡检测实验

  实验步骤:

  一、试剂准备

  1. 三尖杉酯碱(HT):300μg/ml;

  2. Tris-HCl(pH7.5):100mmol/L;

  3. EDTA缓冲液:5mol/L;

  4. 碱性裂解液:0.2mol/L NaOH;

  5. 醋酸钠:3mol/L KAc(pH4.8);

  6. PI母液:500μg/ml;

  7. Ho33342母液:2mmol/L;

  8. 人早幼粒白血病HL-60细胞:用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃,5% CO2条件下培养。

  9. 其他:异丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚蓝、蔗糖指示剂、TBE电泳缓冲液、1%琼脂糖、溴乙锭。

  二、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡

  1. 实验前约24小时,接种两瓶HL-60细胞,标记①、②,每瓶含约6 ml培养液,置37℃,5%CO2培养箱培养。

  2. 实验前约2.5小时,当细胞密度达到70%,①号瓶加入三尖杉酯碱200 μl,使终浓度为1 μg/ml,②号瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。

  3. Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞

  (1)染色:将瓶中的细胞摇匀取200 μl于1.5 ml的离心管中,加入Ho33342母液2 μl,PI 20 μl,染色15分钟。

  (2)滴片:取一载玻片用双面胶围成一小室,从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10 μl,加入小室内盖上盖玻片,荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察,区别三种细胞,并注意三者比例。

  注意事项:

  1. 诱导培养HL-60细胞时间要准确;

  2. 荧光显微镜下观察细胞时,由于荧光易碎灭,观察时要尽量快。

  其他:

  细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

  在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。

  在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。

  相比之下,坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。

  一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

  文章源自:百度学术
 

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