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分子实验-蛋白免疫印迹杂交

发布时间:2021-12-10 10:18:09 阅读:16752次 来源:JoVE

  蛋白免疫印迹杂交用来鉴定电泳分离的样品中是否存在某特定蛋白。样品通过聚丙酰胺凝胶电泳,也称SDS-PAGE得到分离后,再通过凝胶转移将蛋白质从聚丙酰胺凝胶转移到一张膜上,这样可将蛋白质固定在其特定的分离位置。接下来,用抗体对膜进行杂交,这一过程称之为免疫杂交。免疫杂交是通过抗体与目标蛋白、以及抗体与抗体之间特定识别位点的结合来实现,它的高特异性使得可以鉴定单一蛋白。对抗体的识别则用含酶的报告系统来完成。酶结合在抗体的末端,与底物起反应产生颜色或者光的变化。这些信号会被捕捉成像,并可用光密度计量学对其进行定量。

  本文章将通过讲解凝胶转移,抗体识别和图像分析来全面介绍蛋白免疫印迹技术。将重点讨论凝胶转移步骤中的关于如何搭建转移三明治和凝胶转移条件、以及抗体结合与抗体识别的基本原理。 我们还将举例说明该技术的广泛应用, 包括检测蛋白质之间的相互作用和在蛋白复合物中鉴定单个蛋白。

  蛋白免疫印迹杂交

  蛋白免疫印迹杂交是被许多科研人员用来通过抗体鉴定电泳分离样品中是否存在某特定蛋白的强大技术。

  免疫杂交的主要步骤

  该技术的完成需要三个基本步骤:电泳印迹转移、免疫印迹杂交和结果检测。在这些步骤之前,先要进行聚丙酰胺凝胶电泳,它根据蛋白分子大小将变性蛋白进行分离。

  电泳印迹转移,也称凝胶转移,要用到转移夹盒来固定“三明治”,和一个将蛋白质从聚丙酰胺凝胶转移到膜上的装置。电泳转移三明治包含:凝胶和特殊的膜,它们被夹在两张滤纸中间。转移过程中施加的电场将使得蛋白质穿过凝胶,在电荷和疏水作用的帮助下结合到薄膜上。

  免疫印迹杂交是使用抗体检测薄膜上的特定蛋白。抗体是大的Y型蛋白,有两个称之为Fab区域的片段,它们会与其他蛋白结合。Fab区域决定了它识别特定的抗原决定簇,也就是蛋白中抗体结合的特定部分。

  单克隆抗体可以识别单一抗原决定簇,正因为这种特异性,它们是免疫印迹中推荐使用的抗体类型。相比而言,多克隆抗体则是由一系列不同的抗体构成,可以识别同一抗原的多个抗原决定簇,或者一个蛋白中的多个区域。由于线性抗原决定簇存在于在变性或线性蛋白中,识别这些位点的单克隆抗体更受欢迎。因为很多抗体只能识别构象型抗原决定簇,这意味着此类抗体只能在蛋白质拥有正常的3D构象时才起作用。

实验器材

  除了Fab片段,抗体还含有Fc区域, 它们因抗体的不同动物来源而不同。在免疫印迹杂交中,这个区域主要被用作二抗识别的抗原决定簇。二抗是指识别与目标蛋白结合的一抗的抗体。

  为了产生可见的信号,二抗通常在Fc区域连接一种报告酶,譬如碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶。这些报告酶通过和底物的相互作用来释放信号,如颜色的改变或者光信号的改变。

  这些变化可通过光密度计量来定量。光密度计量是一种用图像分析软件计算每个印迹带密度,从而得到蛋白带密度的技术。这些蛋白带都可以通过标准样来定量或者通过对照样品进行内部比较。

  电泳印迹转移

  要进行一次成功的印迹转移,先要将凝胶放在转移缓冲液中平衡15分钟。薄膜也应当根据产品说明进行平衡。

  接下来,在转移缓冲液中仔细准备凝胶转移三明治,注意防止气泡的产生。可以使用移液管在三明治表面滚动挤压从而驱逐产生的气泡。即使很小的气泡也会干扰蛋白质的转移,导致蛋白的不完全转移,如您在这张膜的下半部分看到的。

  凝胶转移三明治准备好后,将其放入转移槽中并加入足够的转移缓冲液,在20-30微安的条件下转移2-3小时。转移缓冲液里含有甲醇,它可以帮助蛋白质结合到膜上。

  等到转移完成,打开三明治。凝胶转移的质量可以通过观察一种非特异性的蛋白质染料丽春红S来检查。它提供了一种迅速并且可逆的检测蛋白带的方法。

  免疫印迹杂交

  免疫印迹杂交的第一步是用稀释的蛋白溶液对薄膜的剩余部分进行封闭。封闭的目的在于防止抗体和薄膜之间的非特异性结合。通常使用的封闭蛋白是牛血清白蛋白或者非脱脂奶粉。通常置于摇床上封闭一个小到过夜。

  接下来将膜孵育在用封闭溶液稀释的一抗溶液中。该步骤可长达30分钟至过夜,并一直保持轻轻震荡。

  然后彻底冲洗膜来降低非特异杂交背景,再将膜孵育在含二抗的封闭溶液中。短暂孵育后,再次彻底冲洗膜。

  二抗由于在末端结合了报告酶,可以被检测到。加入了合适的底物后,比色或化学发光变化可被成像并通过光密度计量来测定。此外,蛋白质标准样是非常有用的分子量大小对照,每个线性蛋白的分子大小可以通过比较它在凝胶中移动的位置与标准样的相对位置来做判断。通过免疫印迹杂交观察检测蛋白的大小是一种很好的方法,可用来是确定抗体是否了识别正确的蛋白,以及检测蛋白是否单聚体或多聚体。

  应用

  成千上万的一抗已被商品化,它们可用于检测和定量样品中特定的蛋白。这里一个研究人员正在使用HIF-1α抗体来测定该受氧浓度调控的转录因子在培养细胞中的表达量,从而进行低氧筛选。他们也使用了抗体检测beta-肌动蛋白来作为上样对照。如您在这里看到的,在正常氧条件下培养的细胞,其表达产生的HIF-1蛋白要远远低于在低氧条件下培养的细胞。

  双向电泳和免疫印迹杂交结合可对蛋白复合物的存在提供有用的信息。这里,样品先按照蛋白复合物大小被分离开,然后将蛋白变性,这样复合物中的每个蛋白依据其分子量大小再次被分开。 用识别三种不同蛋白的抗体检测显示出三种独特的复合物,每个复合物含不同的蛋白,排列在同一纵线。最左边的列中包含beta-2和MCP-21, 和另一种这里未被识别的蛋白。中间的列中显示的是一个含所有三种蛋白的复合物,最右边的列中的复合物仅含beta-2和MCP-21.

  免疫印迹杂交还被用来检测蛋白之间的相互作用。先将蛋白从凝胶中转移到醋酸纤维素膜上,再加入其它蛋白与膜杂交。然后用免疫印迹杂交来检测杂交添加的蛋白是否与转移固定到膜上的任何蛋白有结合。

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