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实验外包:RNA pull down实验步骤

发布时间:2021-10-12 03:32:02 阅读:19112次 来源:本站

  随着高通量测序技术的发展,越来越多的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)被注释出来,其广泛的生物学功能也成为近年来的研究热点。RNA与蛋白质的相互作用是发挥功能的主要作用机制之一,而作为检测RNA与其结合蛋白相互作用的一种重要的手段—RNA pull-down,具有不可或缺的意义。

  简而言之,RNA pull-down实验就是先将RNA进行标记(如生物素探针标记),再与细胞裂解液共同孵育,从而形成RNA-蛋白质复合物,之后再分离复合物得到蛋白质,通过western blot 或mass Spectrometry检测蛋白质的技术。目前RNA pull-down技术已成为研究miRNA、lncRNA与相互作用蛋白的主要技术手段之一。

  RNA pull down 实验步骤

  1、构建 RNA 过表达质粒:基因合成 +测序验证;

  2、体外转录模板准备:设计含 T7 启动子引物,PCR 扩增得到转录模板;

  3、体外转录:以 PCR 产物为模板,体外转录得到目的 RNA;

  4、RNA pull down :通过磁珠 -RNA 探针复合物富集互作的蛋白;

  5、银染质检:SDS -PAGE 电泳银染检测富集蛋白的情况 ;

  6、质谱鉴定:通过质谱鉴定实验组与对照的差异蛋白;进而筛选可能的互作蛋白。

  一、构建RNA过表达质粒

  1、首先通过其他手段筛选确定自己感兴趣的 RNA (以 下讲解lncRNA 为 主);检索数据库找到对应的 RNA 碱基序列;

  2、再通过 RACE 扩增是否存在未知序列,由于 lncRNA-RACE 成功率非常低, 尝试扩增后再确定 RNA pull down 使用的序列;

  3、确认 RNA pull down 使用的序列后,设计引物全基因合成目RNA 序列, 构建到 pcDNA3.1(载体可以根据其他实验灵活替换)过表达中,并测序验证序列准确性;

  4、最后提取过表达质粒备用。

  二、体外转录模板准备

  实验分组:

  实验组:sense 链即目的 RNA 序列

  对照组:antisense 链即目的 RNA 互补序列

  引物设计方法:

  在正向引物前面加入 T7 启动子序列;反向引物不变。

  以构建过表达质粒为模板 +设计合成好的引物,扩增得到体外转录模板,琼脂糖凝胶电泳检测扩增 PCR 产物情况,切取目的条带纯化回收备用。

实验外包

  三、体外转录

  1、以纯化回收的 PCR 产物作为转录模板,用体外转录试剂盒进行转录得到目的 RNA (含 sense 及antisense 两组);

  2、不同试剂盒转录情况(转录RNA 大小、转录 RNA 量等等)会有所不同。

  四、RNA pull down

  1、蛋白液提前准备:

  优先选择细胞系:pull -down 实验前需要提供对应的细胞系,扩大培养后收集细胞裂解提取总蛋白备用;

  组织样品作为备选:动物或者植物组织液氮研磨后超声裂解提取总蛋白备用。由于组织样品需要前处理,且其中包含很多杂质可能会对磁珠富集产生影响,最终影响富集效率导致富集蛋白量较少,进而影响最终鉴定结果。

  2、以上体外转录得到的 RNA ,标记生物素后纯化备用;

  3、标记生物素 RNA 探针与链霉亲和素磁珠共孵育形成复合物;

  4、生物素 RNA 探针 -链霉亲和素磁珠复合物富集蛋白;

  5、富集蛋白洗脱保存。

  五、银染

  电泳→固定→致敏→染色→显色→终止

  六、质谱鉴定

  RNA pull down 富集蛋白质谱通常选择胶条鉴定。

  根据银染结果来选择质谱鉴定的方式:

  A、存在肉眼可见差异条带:

  切取 sense 实验组泳道中的差异条带进行胶鉴定。当差异条带非常多时,节约质谱费用也可以选择 sense 和 antisense 两组蛋白液分别进行质谱。

  B、无肉眼可见差异条带:

  将sense 实验组和 antisense 对照组两蛋白液分别进行全谱鉴定,根据鉴定分析结果找出 sense 实验组中特有的蛋白,进而筛选与自己研究相关的蛋白进行后续验证。

  C、存在浓度差异条带:

  也将 sense 实验组和 antisense 对照组两蛋白液分别进行全谱鉴定, 根据鉴定分析结果找出 sense 实验组中特有的蛋白,进而筛选与自己研究相关的蛋白进行后续验证。

  七、验证实验

  根据 RNA pull -down 质谱鉴定分析结果,筛选与自己研究相关的可能互作蛋白。

  购买对应蛋白 IP 级别抗体;或者构建标签重组过表达质粒 /慢病毒处理细胞。使用目的蛋白抗体或者标签进行 RIP -QPCR实验反向验证。

  内容源自:百度学术

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/384.html

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