ELISA(酶联免疫吸附测定)是一种利用抗体/抗原反应和最终的颜色变化来检测物质含量的检测方法。ELISA试剂盒(ELISA Kits)已成为药物和植物病理学研究中的常用诊断工具，也是很多行业重要的质量控制手段。ELISA试剂盒是检测组织提取液、血清和细胞培养液中目标抗体/抗原的理想工具。

　　酶联免疫吸附作用

　　(1)免疫酶染色各种细胞内成份的定位；

　　(2)研究抗酶抗体的合成；

　　(3)显现微量的免疫沉淀反应；

　　(4)定量检测体液中抗原或抗体成份。

　　本文以检测待测标本中肿瘤坏死因子TNFα的含量介绍双抗体夹心ELISA 法。其基本原理是：抗人TNFα单克隆抗体被固相化在酶标板上，所加入标本中的抗原TNFα被酶标板上的单克隆抗体所捕获，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的抗原;被捕获的TNFα再与加入的生物素化的抗人TNFα二抗结合，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的二抗;生物素再与加入的亲和素-HRP结合，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的亲和素-HRP，HRP与最后加入的底物反应，形成有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

　　实验前准备

　　1、实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材：

　　TNFα的ELISA检测试剂盒为：Human Tumor Necrosis Factor α ELISA Kit。此试剂盒中包含了实验所需的所有主要试剂。

　　2、主要仪器和耗材有：

　　Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪、芬兰百得的各个量程单通道移液器，赛默飞公司的QSP盒装吸头及冰盒等。

　　实验流程

　　本实验操作流程是：样品的稀释;样品与捕获抗体的孵育;洗涤;二抗孵育;洗涤;亲和素-HRP 孵育;洗涤;底物显色;OD 值的检测;标准曲线的绘制与标本中 TNFα 浓度的计算。

　　1、样品稀释

　　(1)预先将冻干的人 TNFα 标准品溶解在适量超纯水中，溶解成浓度为2000pg/ml 母液。

　　(2)取8只1.5ml离心管，做好浓度标记，分别是：1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、0pg/ml。分别吸取200μl的样品稀释液至8个离心管中，取200μl的标准品母液至第1个离心管中，漩涡混匀后吸取200μl至第2个离心管中，同样漩涡混匀后吸取200μl至第3个离心管中，依次稀释至第7个离心管，最后一个标记为零的离心管不含标准品，作为空白对照。

　　2、免疫反应

　　(1)实验中所用到的试剂均需预先从冰箱中取出，室温恢复至常温。

　　(2)按每孔50μl往已包被了人TNFα单抗的酶标板中加入各组样品，每组样品2至3个复孔，首先加入1个空白对照样、然后是7个浓度的标准品、最后是两个稀释倍数的待测样品。加完后轻轻拍打酶标板数次混匀。注意：标准品按浓度梯度依次加样，并且做好各个样品的标记。

　　(3)用盖板膜小心盖好酶标板，确保所有的边缘已密封好，室温孵育 1h。

　　(4)孵育结束后，小心去除板盖膜，吸去板内液体，用 Plate Washing 洗涤酶标板 3 次，将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

　　(5)按每孔100μl加入已稀释好的生物素标记TNFα二抗。

　　(6)盖板膜小心盖好酶标板，确保所有的边缘已密封好，室温孵育 1h。

　　(7)孵育结束后，小心去除板盖膜，吸去板内液体，用 Plate Washing 洗涤酶标板 3 次。将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

　　(8)按每孔 100μl 加入亲和素-HRP，盖板膜小心盖好酶标板，室温避光孵育30min。

　　(9)孵育结束后，小心去除板盖膜，去除板内液体，用 Plate Washing 洗涤酶标板 3 次。将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

　　(10)按每孔 100μl 加入 TMB 显色底物，室温避光反应 30min。

　　(11)30min后，每孔加入100μl Stop Solution终止反应，终止后孔内液体呈现橙黄色。

　　(12)终止后于波长492nm处立即进行OD值的检测。

　　3、吸光值测定：

　　(1)打开Thermo Scientific Skanlt Software软件，点击“New session”新建程序，给程序命名后，点击“Next”;

　　(2)根据所用的酶标板型号选择微孔板的类型，点击“Next”;

　　(3)点击“Finish”进行程序编辑界面;

　　(4)选中“Plate layout”，点击右上角“wizard” 进入填充向导界面;先填充空白对照,“Type”选择Blank，No.of calibrators与No.of replicates分别选择1和2，根据样品的浓度梯度和复孔方向选择箭头方向;

　　(5)点击“Add”添加下一组样品，按相同的方法分别填充标准品和待测样品。

　　(6)填充完样品后，点击“close”关闭填充界面。

　　(7)点击已填充的标准品的孔，分别输入相应的浓度值;

　　(8)点击“Protocol”，选中左边“吸收光波长”图标，在参数栏中把波长设置为492nm;保存设置后;

　　(9)点击“connect”,待连接后点击“三角形”开始键，选择刚才设置的程序后点击“ok”即开始读数，显示结果后，点击程序名下的“Photometric”键， 再点击左边的“Quantitative Curve”键，点击右上边的“Graph”即得到标准曲线和相关参数方程。

　　结果分析

　　查看不同稀释度下待测样品的 OD 值，选取一个 OD 值位于标准曲线 OD 值范围内的结果代入方程，所得结果再乘以稀释倍数即得到被检样品中 TNFα 的含量。