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细胞实验:RNAi实验原理与方法(实验思路及步骤分享)

发布时间:2021-11-09 10:35:47 阅读:113442次 来源:百度学术

  通过生化和遗传学研究表明,RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段,加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明;一个称为Dicer的酶,是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员,它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基,病毒感染等各种方式引入的双链RNA,切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs),每个片段的3’端都有2个碱基突出。

  在RNAi效应阶段,siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了,但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。

  另外,还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.

  实验试剂RNase III、 DNA Oligo、Taq酶、dNTP、氯化钙、磷酸缓冲液、克隆所需试剂、 siRNA合成试剂盒等

  实验步骤

  (一)siRNA的设计

  1. 在设计RNAi实验时,可以先在以下进行目标序列的筛选:

  http://www.genesil。。com/business/products/order2.htm

  http://www.ambion。。com/techlib/misc/siRNA_finder.html

  http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html

  http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710

  1.  RNAi目标序列的选取原则:

  (1)从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,并记下其3'端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。

  Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区(untranslated regions,UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

  (2)将潜在的序列和相应的基因组数据库(人,或者小鼠,大鼠等等)进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。

  例如使用BLAST( www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)

  (3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到zui有效的siRNA序列。

  3.阴性对照

  一个完整的siRNA实验应该有阴性对照,作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱,同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。

  4.目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到:

  http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49

  http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html

  http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html

  http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published

  (二)siRNA的制备

  目前为止较为常用的方法有通过化学合成,体外转录,长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA,以及通过siRNA表达载体或者病毒载体,PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。

细胞实验

  体外制备

  1.化学合成

  许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出zui有效的序列再进行化学合成。zui适用于:已经找到zui有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究。不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素

  2.体外转录

  以DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs,成本相对化学合成法而言比较低,而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小,稳定性好,效率高,只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果,从而使转染效率更高。zui适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。

  3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA

  其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ,然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化,得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。

  dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱(注意:通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜)。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。

  zui适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型

  不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进行研究,特别是基因治疗体内表达前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs,并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于:从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

  4. siRNA表达载体

  多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。

  病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。zui适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默。不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)。

  5. siRNA表达框架

  siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,包括一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol III终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间。因此,SECs成为筛选siRNA的zui有效工具,甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的zui适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点,那么通过SECs筛选出的zui有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。

  这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中(晶赛公司的Protocol可以解决这一问题)②不能进行序列测定,PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。zui适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选*启动子不适用于:长期抑制研究。(如果克隆到载体后就可以了)

  (三)siRNA的转染

  将制备好的siRNA,siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法:

  将氯化钙,RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合,沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准,保证质量,因为甚至偏离*条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/475.html

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