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实验外包:什么是工具酶呢?实验中常用的工具酶集合

2021-10-12 03:16:02
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  作为试剂用于测定化合物浓度或酶活力的酶称为工具酶。

  对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应,采用酶耦联法测定。

  1.NAD(P)十或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应。

  2.偶联H2O2的工具酶及其指示反应

  有些酶作用于底物时,可使其氧化产生H2O2,在POD的作用下使色素原氧化显色进行测定。

  (1)使单一的色素原显色:色素原是一种无色的色素前身,在过氧化物酶(POD)存在下被H2O2氧化后可生成有色的色素。如邻联茴香胺(ODA)。

  (2)使成对的色素原显色:必须有两个色素原共同存在,再在过氧化物酶(POD)的催化下生成色素。如酚和4-氨基安替比林作用,生成红色色素。

  (3)发光反应:H2O2也可用化学发光反应来监测。

  (六)标本采集要点及酶活性表示法

  1.部分分析前因素对酶活性测定的干扰

  1)溶血:部分酶在红细胞膜或红细胞内的浓度远高于细胞外,少量红细胞的破坏就可能引起血清中酶明显升高。

  2)抗凝剂:有些抗凝剂是金属螯合剂,可以抑制需要金属离子的酶。如草酸盐、柠檬酸盐和EDTA等可抑制需Ca2+的AMY,也可抑制需Mg2+的CK,草酸盐可以抑制催化氧化还原的酶,EDTA还能抑制ALP,这些抗凝剂分离的血浆一般不宜做酶活性测定。肝素可使γ-GT升高,使AMY下降,需加注意。

  3)标本储存温度:

  血清白蛋白对酶蛋白有稳定作用,如无细菌污染,某些酶(如AST、γ-GT和ALP等)存在于白蛋白中可在室温保存1~3天,而对活性影响不大。

  有些酶极不稳定,如血清前列腺ACP,在37℃放置1小时,活性可下降50%。大部分酶在低温中可稳定较长时间,标本如在离体后不能及时测定,应及时分离血清或血浆并置于冰箱冷藏。

  2.标本采集要点

  酶测定之前,标本要经过采集、分离血清和储存等过程,酶在血中是处于动态变化过程,血液离开体内后,会有一定变化。其中任何一个阶段处理不当,都有可能引起测定值变化。

  (1)不能溶血:因大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多。如LDH高150倍,ALT高7倍。

  (2)及时分离血细胞:防止血细胞内酶大量进入血清;采血后1~2小时实验室必须及时离心,分离血清。

  (3)及时测定:防止酶蛋白变性,分离血清如不能及时测定,应放冰箱保存。

  (4)尽量用血清标本:防止某些抗凝剂对酶的抑制作用(除非测定与凝血或纤溶有关的酶)。

  (5)有些标本不能冷冻:有的酶在低温下不稳定。

  有些酶如LD在融冻时被破坏,LD在低温反而不如室温稳定,即所谓的“冷变性”。

  3.酶活性表示法

  酶活性的大小通常以酶单位数表示。

  酶的国际单位:在实验规定的条件下(温度、最适pH、最适底物浓度时),在1分钟内催化1μmol底物发生反应所需的酶量为1个酶活力国际单位(U)。

  能够真正代表酶活性大小的是酶促反应初速度

  工具酶是在基因工程的重组 DNA 过程中,所需要用到的酶的统称。基因工程是指在人工可以控制条件下,将基因剪切或重新组合,再导入另一生物体内,使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。 核心是对基因进行人工切割、连接和重新组合,构建重组 DNA 。

  1、 I 型限制性内切酶

  同时兼有切割 DNA 的功能和修饰酶的修饰功能。在酶的识别位点上,若 DNA 两条链菌没有发生甲基化,则行使内切酶的功能,对 DNA 进行切割,同时转变成 ATP 酶。若 DNA 双链中有一条链已发生甲基化,则此类酶显示修饰酶的作用,对另一条 DNA 进行甲基化修饰,然后在行切割功能。 (实际上,有内切酶、修饰酶、 ATP 酶及解旋酶四种功能)

  I 型限制性内切酶在 DNA 链上的识别位点和切割位点不一致,也不固定。没有时间应用价值。

  DNA 甲基化: DNA 化学修饰的一种形式,能在不改变 DNA 序列的前提下, 改变遗传表现(外遗传机制)。 多发生于 CpG 二核苷序列上(在甲基转移酶的催化下, DNA 的 CG 两个核苷酸中的胞嘧啶被选择性添加甲基,形成 5-甲基胞嘧啶)。 甲基化位点可随 DNA 的复制而遗传( DNA 复制后,甲基化酶可将新和成的未甲基化的位点进行甲基化)。 DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化,使 DNA 失去限制性内切酶的切割位点,以及 DNA 酶的敏感位点,使染色质高度螺旋化,凝缩成团,失去转录活性。

  2、 II 型限制性内切酶

  也具有限制 -修饰系统,但由限制酶和修饰酶这两种不同的酶共同来执行这一系统的功能。 即 II 型限制性内切酶有在识别位点的切割功能, 而不具备甲基化修饰活性,修饰作用由相应的修饰酶完成。 两种酶识别同一 DNA 特定序列, 却发挥不同作用。

  能识别双链 DNA 的特异顺序,并在该顺序内的固定位置上进行切割,产生特异的 DNA 片段。

  II 型限制性内切酶的识别位点和切割位点是专一和固定的, 对相同的基因片段的切割,总是得到同样核苷酸顺序的小 DNA 片段。这些切割后的不同大小的DNA 片段,可以与统一内切酶切割后的来源不同的其他 DNA 片段实行连接, 而构建重组 DNA 。

  II 型限制性内切酶识别的专一核苷酸顺序,最常见的是 4~6 个碱基对。

  II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序(反转重复顺序),具有180°的旋转对称性。 识别顺序有一个中心对称轴, 从这个轴朝两个方面读序都是相同的。

  3、 III 型限制性内切酶

  具有内切酶和甲基化修饰酶作用。具有专一的识别顺序, 其切割位点在识别顺序旁边的几个核苷酸对的固定位置上。(可识别短的不对称序列,切割位点与识别序列约距 24~26bp)

  4、同工酶( Boschizomer)

  来源不同的两种 II 型内切酶, 它们识别核苷酸顺序及切割位点都相同, 差别只在于当识别核苷酸序列中有甲基化的核苷酸时, 一种内切酶可以切割,而另一种不能。

  如: Hpa II 和 Msp I 识别顺序都是 5’··CCGG ··3’,若其中有 5-甲基胞嘧啶,则只有Msp 酶可切割( GGmCC)。

  5、Subset酶

  识别顺序及切割位点相互有关的酶,互称 Subset酶。

  如: Sam I 酶所识别的 6 个核苷酸顺序中含有 Hpa II 酶识别的 4 个核苷酸顺序。所以这两个酶可以相互代替使用,它们所切割的 DNA 片段可以相互连接。

  6、可变酶(特殊的)

  识别核苷酸顺序一般都大于 6 个,但其中一个或几个核苷酸时可以变化的。

  7、远距离切割酶

  识别核苷酸顺序的位置与切割的位点不一致,一般切割位点与 指标核苷酸顺序的位置之间有 10 个左右核苷酸的距离。 与 I 型内切酶相似, 不过 I 型内切酶识别位点与切割位点的距离更远一些。

  8、甲基化酶(不属于内切酶)

  使识别顺序中的某个核苷酸发生甲基化, 保护 DNA 不被限制性内切酶切开。

  M 5C( 5-甲基胞嘧啶)大多数以 M 5CpG 的形式存在,即 CpG 岛中的 C 最容易是甲基化的底物, 而甲基化又与受之调控的基因的表达程度有关。 因此, 研究CpG 岛的甲基化是研究基因调控的一个重要方向。

  当甲基化酶和限制性内切酶共同使用时, 常常可以使有多个识别位点的内切酶只对其中一个识别位点有切割效果,其他位点因被甲基化酶修饰而不能被切割。

  9、DNA 聚合酶( DNA polymerase )

  将一个脱氧三磷酸核苷酸加到引物( primer )的 3’-OH 上,再释放出一个焦磷酸分子( ppi )。

  聚合酶 I、II 主要参与 DNA 修复, III 主要参与 DNA 复制。三种都有沿模板按 5’→3’方向合成互补 DNA 链的活性和按 3’→5’向的外切酶活性。聚合酶 I 还有5’→3’向的外切酶活性。

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