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病理实验:病毒空斑实验怎么做?

2021-08-17 02:07:53
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  以乙型脑炎病毒感染BHK-21细胞为例

  第一步:溶液配制

  1、2%羧甲基纤维素纳覆盖培养基:先取4g粉状羧甲基纤维素纳溶入100ml蒸馏水,高温高压灭菌,再放入冰箱。使用前无菌操作按1:1比例加入2倍DMEM培养基(含有2%FBS和1%双抗),混匀放入冰箱,过一天后再拿出,反复摇匀,使纤维素达到一种匀质的状态,静置至泡沫完全消失后使用。

  2、结晶紫:取0.34g粉剂加到15ml 95% 医用酒精中,溶解后再用蒸馏水定溶到100ml。

病毒空斑

  第二步:空斑实验

  1、BHK-21细胞培养;

  2、对BHK-21细胞进行计数,按一定比例接入24孔板;

  3、24h后,弃培养液,用PBS洗两次;

  4、接种乙型脑炎病毒:接种病毒液0.1ml/孔,病毒液按10倍梯度稀释,可以做重复;

  5、放入37度5%CO2培养箱1h,期间每15min慢摇一次,使病毒充分吸附;

  6、弃病毒液,用PBS洗涤细胞三次。加入2%羧甲基纤维素纳覆盖培养基(1ml/孔),放入37度5%CO2培养箱继续培养;

  7、3天后,吸弃培养基;

  8、加入5%甲醛1ml/孔固定4min,弃甲醛,加入结晶紫0.8ml/孔染色20min;

  9、蒸馏水缓缓冲洗染液,计算空斑数。

  注意事项:2%羧甲基纤维素纳覆盖培养基在配制过程中一定要充分摇匀;病毒吸附后一定要洗涤,以防后期空斑数不准确;接毒后的细胞培养时间不同病毒会有不同,按实际情况来处理;避免多次观察细胞培养板,会很容易造成病毒移位,空斑变大。

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