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病理实验:病原体检测技术详解

发布时间:2021-08-16 04:53:18 阅读:12472次 来源:本站

  摘要:病原微生物种类繁多,变异迅速,快速鉴定病原微生物的检验技术也在不断发展前进着。目前,应用比较广泛的病原微生物检测方法主要有直接涂片镜检、分离培养、生化反应、血清学反应、核酸分子杂交、基因芯片、多聚酶链反应等,本文对这些检测技术进展做一综述。

  对人和动物具有致病性的微生物称为病原微生物,又称病原体,有病毒、细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊粒等。这些病原微生物可引起感染、过敏、肿瘤、痴呆等疾病,也是危害食品安全的主要因素之一。近年来出现的SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒感染等疾病的传染性极强,往往造成世界性大流行,因此对病原体的检测必须做到快速、准确。常规病原学检测方法操作繁琐,检测周期长,而且对操作人员技术水平要求比较高。随着医学微生物学研究技术的不断发展,病原学诊断已不再局限于病原体水平,深入到分子水平、基因水平的检测手段不断出现并被应用于临床和实验室。核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术等检测方法,自动化程度高,快速省时、无污染、结果精确,可以准确灵敏地鉴定病原微生物。

  1 传统的病原微生物的检测方法

  传统的病原微生物学实验室检查以染色、培养、生化鉴定等为主,将标本直接涂片染色镜检和接种在培养基上进行分离培养是对细菌或真菌感染性疾病进行病原学诊断的常用方法。

  1.1 直接涂片染色镜检

  病原微生物体形体积微小,大多无色半透明状,将其染色后可借助显微镜观察其大小、形态、排列等。直接涂片染色镜检简便快速,对那些具有特殊形态的病原微生物感染仍然适用,例如淋球菌感染、结核分枝杆菌、螺旋体感染等的早期初步诊断。直接涂片镜检不需要特殊的仪器和设备,在基层实验室里仍然是十分重要的病原微生物检测手段。

  1.2 分离培养与生化反应

  分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。细菌的生长繁殖需要一定时间,检测周期较长,不能同时处理批量样本。为解决这一问题,各种自动化培养和鉴定系统不断产生,传统鉴定方法也在逐步改进,大大加快了检验速度。

  1.3 组织细胞培养

  活组织细胞培养适于专营活组织细胞内生存的病原体,包括病毒、立克次体、衣原体等。不同病原体敏感的组织细胞是不一样的,将活细胞从病原体敏感的动物组织中取出在体外进行原代培养或用病原体敏感细胞系进行传代培养,再将病原体接种于相应的组织细胞中后,病原体可在其中繁殖增长,引起特异性的细胞病变效应。也可以将病原体直接接种于敏感动物体内,引起相应组织器官出现特异的病理学改变。往往可以根据这些特异的病变对病原体进行鉴定。

  2 血清学与免疫学检测

  血清学检测是通过已知的抗体或抗原来检测病原体的抗原或抗体从而对病原体进行快速鉴定的技术,简化了鉴定步骤,常用的方法包括血清凝集技术、乳胶凝集实验、荧光抗体检测技术、协同凝集试验、酶联免疫测试技术等。酶联免疫技术的应用大大提高了血清学检测的敏感性和特异性,不仅可检测样本中病原体抗原,也可检测机体的抗体成分。幽门螺奸菌在我国人群感染率高达50% ~80% ,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测唾液中抗HP抗体来诊断HP感染,其结果满意。乙型肝炎病毒(HBV)在我国人群中感染率极高,ELISA应用于乙型肝炎病人早期血清学诊断的效果最为明显。

  临床上致病菌往往和非致病菌混合在一起,如何从这些细菌中分离出目标菌是关键。

  3 基因检测

  随着科技水平发展,分子生物学检测技术日新月异,对病原微生物的鉴定已不再局限于对普通外部形态结构和生理生化特性等的一般检验上,而是深入到了分子水平、核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特异的,有别于其他种或属,检测其特有的基因片段序列可用来鉴别病原微生物。随着科技的发展,基因检测技术逐渐代替其它检测技术,成为临床检验科和基础实验室对病原体的主流检测技术。

  3.1 核酸杂交技术

  具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔成异质双链的过程叫核酸杂交,其杂交双方是所使用探针和要检测的核酸。在病原微生物检测中核酸分子杂交主要包括膜上印迹杂交和核酸原位杂交两种。膜上印迹杂交是指将核酸从微生物细胞中分离出来,纯化后在体外结合到一定的固相支持物上,与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交。核酸原位杂交是指标记的核酸探针直接与细胞或组织切片中的核酸进行杂交。探针还可以用荧光标记,在荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下即可鉴别病原体还可显示在三维空间中的位置。核酸分子杂交检测技术与其它方法相比显著地优点是简便、敏感、快速、特异。Wong 等用荧光标记2个不同的寡核苷酸探针从血液标本中检测出假单胞菌属和不动杆菌属的细菌,最低检测限为10 cfu·mL~,特异度为100% ,检测时间不到2 h。寡核苷酸探针是针对病原体特异基因序列设计的,可以将待检测的病原体定位在不同的分类等级,如科、属、种、亚种“ 。(病原微生物检测技术进展)

  3.2 基因芯片技术

  基因芯片(DNA chip)又称为DNA微阵列(DNA microarray)或DNA芯片,是生物芯片的一种,是核酸分子杂交技术发展延伸而来的。通过微加工技术,将数以万计甚至百万计的基因探针即DNA片段有规律地排列成二维DNA探针阵列,固定到硅片、玻片等固态支持物上,与标记的样品分子进行核酸杂交,用于基因检测工作。其测序原理与核酸杂交一样,但解决了传统核酸杂交技术操作繁杂、检测效率低、自动化程度不高的缺点。基因芯片在病原微生物感染诊断上的应用,大大缩短了确诊所需要的时间,而且能检测出病原体是否耐药、对那些抗生素耐药、对那些抗生素敏感。基因芯片技术同样还有些问题有待解决,如提高芯片的特异性和检测信号的敏感性,降低芯片的制作成本等,而且多数芯片都需要昂贵的检测仪器,这些问题使得基因芯片到目前主要局限于实验室研究而未能广泛应用于临床病原微生物的检测与鉴定。

  3.3 PCR技术

  聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种在体外是用已知寡核苷酸引物引导未知片段中微量待测基因片段并进行扩增的技术。由于PCR可以对待测基因进行扩增,特别适用于病原体感染早期的诊断,但是如果引物特异性不强,可能会造成假阳性的出现。PCR技术在近20年里发展迅速,从基因扩增到基因的克隆和改造以及遗传分析,可靠性逐步提高。1988年Chamberian等提出了多重PCR的概念,同一PCR反应体系里加上二对以上引物,可同时扩增出多个核酸片段,适合大量样本的分析与鉴定。

  多重PCR具有:(1)高效性,在同一反应体系内可同时检出多种病原微生物,或对同一病原微生物的不同型别进行分型;(2)系统性,多重PCR很适宜于成组病原体的检测,如几种肝炎病毒同时感染;淋球菌、梅毒螺旋体、艾滋病病毒等多重性病病原体的感染;需特殊培养的无芽胞厌氧菌感染;破伤风杆菌,炭疽杆菌,产气荚膜杆菌,鼠疫耶尔森菌等战伤感染细菌感染;(3)经济简便性,多种病原体在同一反应管内同时被检出,节省试剂、节约费用、节省时间,为临床提供更快更多更准确的诊断信息。

  实时荧光定量PCR,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。具有高度灵敏、高度特异、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时荧光定量PCR对性病病原体早期确诊、窗口期筛查、疗效检测、基因变异分析和预后评估等具有重要价值,为流行病学调查提供帮助。荧光基团标记的特异性引物可准确反映病原体感染和药物疗效,特别适用于不可人工培养和难以培养的病原体如病毒、衣原体等感染的诊断。

  基因芯片技术与多重PCR结合可以通过PCR对目的基因进行放大,通过基因芯片的荧光探针增加检测的灵敏性和特异性,使得两种检测技术的优势互补,已广泛应用于病原微生物的检测。将病原体特异性基因作为靶基因设计出引物与探针,进行多重PCR扩增,制备出寡核苷酸芯片,再对待测样本靶基因进行多重PCR扩增,将扩增产物与病原菌多重PCR基因芯片检测体系杂交,可根据杂交信号直观地判读样品中所含病原体的种类、型别、毒力、侵袭力,从而对病原体进行检测和鉴定。

  3.4 等温核酸扩增检测技术

  分子生物学技术飞速发展,各种新的基因检测手段不断出现。PCR在应用时也是存在一些缺陷,比如需要反复变温,反应时间还是较长,仪器的要求还是较高,这时就出现了等温核酸检测技术,苏州先达基因公司研发团队研发了具有全球自主知识产权等温核酸扩增技术,酶促重组等温扩增技术(ERA技术)。凭借其技术在核酸检测领域开发了三大核心,1、体温扩增技术,能在恒温条件下,将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平;2、单分子荧光检测技术,集恒温扩增与荧光信号检测于一体,可实现扩增过程的实时检测;3、核酸快速释放技术,为实验节省更多的时间。该方法低温条件下(25-42℃)可对痕量的靶DNA片段进行特异性的扩增,在最适温度35-40℃时,扩增反应时间仅需15分钟,其低温适应性和灵敏度等方面取得了重大突破并达到国际先进水平,而且摆脱国外专利壁垒,该技术已广泛应用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌、副溶血性弧菌、李斯特氏菌等病原体检测。

  4 小结与展望

  对病原体进行快速准确的检测和鉴定是传染病防治工作的首要问题。随着生物学研究由宏观领域向微观领域的发展,病原体检测方法也从组织形态学水平深入到分子水平、基因水平。近年来发展起来的病原微生物高通量检测技术样本需要量少、快速省时、无污染、诊断结果精确、自动化程度高,相信随着研究的不断进展和深入,这些高通量诊断技术和方法必将在病原微生物的诊断分析方面起到越来越重要的作用,而多种检测技术的联合和综合更是有着广阔的应用前景。

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