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96孔板检测细菌生物膜方法

2022-12-07 10:42:27
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  细菌生物膜也叫菌膜,于19世纪20年代由Angst观察船体表面上海洋细菌时提出。随着显微镜技术和分子生物学的快速发展,人们对菌膜的研究越来越深入。在所有的检测方法中,利用96孔板进行菌膜的定量检测是一种操作简单、且成本低廉的方式。

  96孔板测定法用于观察静置培养的细菌菌膜,是目前测量菌膜生成常用的方法。其需要的仪器及操作步骤如下:

  主要试剂和仪器:

  聚苯乙烯96孔板,PBS缓冲液,甲醇,1%的结晶紫溶液,33%的冰醋酸溶液,酶标仪或分光光度计。

  实验步骤:

  (1)将培养液100μl加入96孔聚苯乙烯微板培养板的各孔中,接种过夜培养液10μl,在37℃下孵育36小时。

  (2)吸出培养液,向每个孔中加入200μl无菌PBS缓冲液,洗涤平板孔3次;

  (3)在每孔中加入100μl甲醇,持续15分钟,然后吸出培养孔中的甲醇,自然风干;

  (4)向每个孔中加入100μl1%的结晶紫溶液,并在室温下染色5分钟;

  (5)将培养液中的结晶紫染色液吸出后,用流水冲洗掉多余的染料;

  (6)倒置滤纸上的板以除去残留的水,并在37°C的烤箱中干燥或在室温下干燥;

  (7)完全干燥后,向各孔中加入100μl的33%冰醋酸溶液,并在37℃的恒温箱中作用30分钟,使结晶紫溶解。

  (8)用酶标仪在590nm处测量培养孔中溶液的OD值;

  (9)在每个测试中为每个菌株重复3孔,并取3个平均值(D值)作为测试值;

  (10)将未接种细菌的培养液用作阴性对照,该阴性值为极限值(Dc)的两倍。

  结果判断:

  根据D值,应变可以分为三类:

  (1)生物膜形成力强(D> 2×Dc);

  (2)生物膜形成力弱(Dc<D≤2×Dc);

  (3)没有生物膜形成应变(D≤Dc)。

  以上是利用96孔板对细菌生物膜进行定量检测的具体步骤,在操作时需要注意气流方向,可能带菌的物品、手不要在上风处移动,以免影响检测结果。

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