细菌生物膜也叫菌膜，于19世纪20年代由Angst观察船体表面上海洋细菌时提出。随着显微镜技术和分子生物学的快速发展，人们对菌膜的研究越来越深入。在所有的检测方法中，利用96孔板进行菌膜的定量检测是一种操作简单、且成本低廉的方式。

　　96孔板测定法用于观察静置培养的细菌菌膜，是目前测量菌膜生成常用的方法。其需要的仪器及操作步骤如下：

　　主要试剂和仪器：

　　聚苯乙烯96孔板，PBS缓冲液，甲醇，1%的结晶紫溶液，33%的冰醋酸溶液，酶标仪或分光光度计。

　　实验步骤：

　　(1)将培养液100μl加入96孔聚苯乙烯微板培养板的各孔中，接种过夜培养液10μl，在37℃下孵育36小时。

　　(2)吸出培养液，向每个孔中加入200μl无菌PBS缓冲液，洗涤平板孔3次;

　　(3)在每孔中加入100μl甲醇，持续15分钟，然后吸出培养孔中的甲醇，自然风干;

　　(4)向每个孔中加入100μl1%的结晶紫溶液，并在室温下染色5分钟;

　　(5)将培养液中的结晶紫染色液吸出后，用流水冲洗掉多余的染料;

　　(6)倒置滤纸上的板以除去残留的水，并在37°C的烤箱中干燥或在室温下干燥;

　　(7)完全干燥后，向各孔中加入100μl的33%冰醋酸溶液，并在37℃的恒温箱中作用30分钟，使结晶紫溶解。

　　(8)用酶标仪在590nm处测量培养孔中溶液的OD值;

　　(9)在每个测试中为每个菌株重复3孔，并取3个平均值(D值)作为测试值;

　　(10)将未接种细菌的培养液用作阴性对照，该阴性值为极限值(Dc)的两倍。

　　结果判断：

　　根据D值，应变可以分为三类：

　　(1)生物膜形成力强(D> 2×Dc);

　　(2)生物膜形成力弱(Dc<D≤2×Dc);

　　(3)没有生物膜形成应变(D≤Dc)。

　　以上是利用96孔板对细菌生物膜进行定量检测的具体步骤，在操作时需要注意气流方向，可能带菌的物品、手不要在上风处移动，以免影响检测结果。