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琼脂糖凝胶电泳定义、原理、部件、步骤、应用

发布时间:2022-01-13 09:49:40 阅读:114702次 来源:百度学术

  什么是琼脂糖凝胶电泳?

  琼脂糖凝胶电泳是一种凝胶电泳方法,用于生物化学、分子生物学、遗传学和临床化学,以分离琼脂糖基质中的大分子混合群,例如 DNA、RNA 或蛋白质。

  琼脂糖是从海藻中提取的天然线性聚合物,当在缓冲液中加热并冷却时,通过氢键形成凝胶基质。

  它们是分离中、大型核酸最常用的介质,分离范围广。

琼脂糖凝胶电泳

  琼脂糖凝胶电泳原理

  凝胶电泳在固体支持介质(如琼脂糖凝胶)中按大小分离DNA片段。将样品 (DNA) 移液到样品孔中,然后施加电流,使带负电荷的 DNA 迁移(电泳)向阳极、正极 (+ve) 端。迁移率与大小成正比:较小的片段移动得更快,并在凝胶底部结束。

  通过在凝胶中加入一种嵌入染料溴化乙锭来使 DNA 可视化。DNA 片段在通过凝胶迁移时会吸收染料。用紫外光照射会使嵌入的染料发出荧光。

  较大的片段发出更强烈的荧光。尽管一类分子的每个片段都以等摩尔比例存在,但较小的片段包含较少的 DNA 质量,吸收的染料较少,因此荧光强度较低。一组已知大小的 DNA 片段“阶梯”可以同时运行,并用于估计其他未知片段的大小。

  琼脂糖凝胶电泳的要求/仪器

  进行琼脂糖凝胶电泳所需的设备和用品相对简单,包括:

  的电泳室和电源

  凝胶浇注托盘,有多种尺寸可供选择,由紫外线透明塑料制成。在流延凝胶时,托盘的开口端用胶带封闭,然后在电泳前将其移除。

  样品梳,熔融介质在其周围倾倒以在凝胶中形成样品孔。

  电泳缓冲液,通常是 Tris-acetate-EDTA (TAE) 或 Tris-borate-EDTA (TBE)。

  上样缓冲液,其中包含稠密的物质(例如甘油)以使样品“落入”样品孔中,以及一种或两种示踪染料,它们在凝胶中迁移并允许目视监测或电泳进行了多远。

  染色:当在外在的氟溴化乙锭存在下进行电泳时,DNA 分子在紫外灯下很容易显现。或者,可以在电泳分离后通过将凝胶浸泡在溴化乙锭溶液中对核酸进行染色。当插入双链 DNA 时,该分子的荧光大大增加。也可以用外在的氟 1-苯胺基 8-萘磺酸盐检测 DNA。

  Transilluminator(紫外线灯箱),用于可视化凝胶中染色的 DNA。

  琼脂糖凝胶电泳的步骤

  为了制备凝胶,将琼脂糖粉末与电泳缓冲液混合至所需浓度,并在微波炉中加热使其熔化。

步骤图

  琼脂糖凝胶浓度

  使用的琼脂糖百分比取决于要分离的片段的大小。

  琼脂糖的浓度是指琼脂糖占缓冲液体积的百分比 (w/v),琼脂糖凝胶通常在 0.2% 到 3% 的范围内。

  琼脂糖浓度越低,DNA 片段迁移速度越快。

  一般来说,如果目的是分离大的 DNA 片段,应该使用低浓度的琼脂糖,如果目的是分离小的 DNA 片段,建议使用高浓度的琼脂糖。

  将溴化乙锭添加到凝胶中(终浓度 0.5 ug/ml)以促进电泳后 DNA 的可视化。

  将溶液冷却至约 60oC 后,将其倒入装有样品梳的浇铸托盘中,并使其在室温下固化。

  凝胶凝固后,取下梳子,注意不要撕开孔的底部。

  凝胶仍然在塑料托盘中,水平插入电泳室并用缓冲液覆盖。

  然后将含有与上样缓冲液混合的 DNA 的样品移液到样品孔中,将盖子和电源线放在设备上,并施加电流。

  电流可以通过观察从电极上脱落的气泡来确认。

  DNA 将向正电极迁移,正电极通常是红色的,因为它带有负电荷。

  可以通过目测监测溴酚蓝和二甲苯青染料等示踪染料的迁移来判断 DNA 在凝胶中迁移的距离。

  琼脂糖凝胶电泳的应用

  琼脂糖凝胶电泳是分离蛋白质、DNA 或 RNA 的常规方法。

  估计 DNA 分子的大小

  PCR 产物分析,例如分子遗传学诊断或基因指纹图谱

  在 Southern 分析之前分离受限基因组 DNA,或在 Northern 分析之前分离 RNA。

  琼脂糖凝胶电泳广泛用于估计用限制性内切酶消化后 DNA 片段的大小,例如在克隆 DNA 的限制性作图中。

  琼脂糖凝胶电泳通常用于解析具有不同超螺旋拓扑结构的环状 DNA,以及解析因 DNA 合成而不同的片段。

  除了为片段大小分析提供出色的介质外,琼脂糖凝胶还可以纯化 DNA 片段。由于纯化在琼脂糖凝胶中分离的 DNA 片段大小对于许多分子技术(如克隆)是必要的,因此能够从凝胶中纯化感兴趣的片段至关重要。

  琼脂糖凝胶电泳的优点

  对于大多数应用,只需要单组分琼脂糖,不需要聚合催化剂。因此,琼脂糖凝胶制备简单快速。

  凝胶易于倾倒,不会使样品变性。

  样品也可以回收。

  琼脂糖凝胶电泳的缺点

  凝胶在电泳过程中会熔化。

  缓冲区可能会耗尽。

  不同形式的遗传物质可能以不可预测的形式存在。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/717.html

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