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分子实验-染色体免疫共沉淀(ChIP)测序原理及步骤

发布时间:2022-01-01 10:43:23 阅读:113472次 来源:搜狐基因狐

  染色体免疫共沉淀(ChIP, chromatin immunoprecipitation)是一种用于研究蛋白质与DNA的体内相互作用的经典实验技术。采用特异性抗体将目的蛋白进行免疫沉淀,由此可以把目的蛋白所结合的基因组DNA片段也富集下来。通过与高通量测序技术的结合,对ChIP后的DNA产物进行测序分析,从全基因组范围内寻找目的蛋白的DNA结合位点,以高效率的测序手段得到高通量的数据结果。

免疫共沉淀

  染色体免疫共沉淀实验流程

  1 ChIP免疫沉淀实验流程

  免疫沉淀实验流程目前主要有两种不同的ChIP实验方法:

  1.2 Cross-liking Chromatin Immunoprecitation (交联染色质免疫沉淀,X-ChIP)

  1.甲醛处理细胞,使 DNA-protein 的相互结合作用被交联固定。

  2.裂解细胞,得到全细胞裂解液。

  3.超声处理,将基因组 DNA 打断至 100-500bp。

  4.抗体免疫沉淀:在细胞裂解液中加入一抗和 beads,并进行孵育。

  5.采用合适的实验条件进行洗脱,并解交联。

  6.通过 qPCR 对 ChIP 结果进行验证。

  7.准备好的 ChIP 后的 DNA 样品可以用于 ChIP Sequencing 建库。

  1.1 Native Chromatin Immunoprecipitation (自然染色质免疫沉淀,N-ChIP)

  1.通过非变性的方式得到核裂解液。

  2.微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease)消化染色质,得到单核小体或核小体寡聚体。

  3.抗体免疫沉淀:在细胞裂解液中前后加入一抗和 beads,并进行孵育。

  4. DNA 分离。

  5.通过 qPCR 对 ChIP 结果进行验证。

  6.准备好的 ChIP 后的 DNA 样品可以用于 ChIP Sequencing 建库。

  2 ChIP免疫沉淀生物信息分析流程

  由Illumina测序产生的数据通过质量控制以及过滤,借助比对工具与参考基因组比对。提取比对上唯一位置的序列,结果以bed文件存放,用bed文件做后续信息分析,包括read的分析和peak扫描。在全基因组范围对peak进行扫描,对于扫描到的peak,对其相关联的基因进行分析,包括GO以及Pathway富集分析。另外对于多样品,还可以做样品间差异Peak的鉴定。

  信息分析流程如下:

 1640921480123862.png ChIP免疫沉淀生物信息分析流程

ChIP免疫沉淀生物信息分析流程

ChIP免疫沉淀生物信息分析结果

  ChIP免疫沉淀生物信息分析结果

  3 样品要求

  1、目的基因或转录因子的相关背景资料;

  2、ChIP检测专用抗体(或者由钟鼎提供)

  3、细胞:细胞数大于5×106个,1%甲醛固定细胞后,PBS清洗细胞3次,离心收集细胞沉淀,液氮速冻,-80℃保存,干冰运输。

  4、组织:动物不少于400mg,植物不少于2g,离体后迅速超低温处理并-80℃冻存 的组织样品,干冰运输。

  4 相关名词解释

  Chip-seq

  染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,将ChIP与第二代测序技术相结合为ChIP-Seq

  Raw reads

  测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据,我们称为raw data或raw reads,结果以FASTQ文件格式存储

  Clean reads

  过滤掉不合格reads后的数据,用于后续比对分析Unique mapping reads比对到参考序列上唯一位置的reads

  Peak

  基因组上Reads富集区域

  Peak相关基因

  相关基因根据Peak在基因组上的区域信息及基因的注释信息,得到关于Peak相关基因

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/623.html

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