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分子实验-染色质免疫共沉淀(ChIP)原理及注意事项

发布时间:2022-01-02 10:34:01 阅读:111022次 来源:百度学术

  早期,人们就发现在细胞的生命活动中,DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等,都涉及基因-蛋白质相互作用,很多生理学家都探讨了这种现象的发生过程。

  近年来,随着研究的深入,很多医学研究者已经将目光投向了基因-蛋白相互作用,期望在此水平上,另辟蹊径,深入分析癌症、心血管疾病、中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路和发生机制。

  染色质免疫共沉淀(ChIP)作为目前为止唯一的研究体内DNA与蛋白质相互作用的实验方法,深得人心。很多人都希望接触和掌握此实验技术,希望从组蛋白修饰、转录调控、凋亡等角度深入研究病变机制,进而开发相应的药物。

  总之,ChIP是一个有效且重要的实验技术。

分子实验-染色质免疫共沉淀(ChIP)原理及注意事项 

  【 正文 】

  能够与DNA结合的蛋白有多种,主要分为组蛋白和非组蛋白。

  一方面,染色体是由组蛋白和DNA构成的,组蛋白作为染色体的结构蛋白,可以与DNA形成核小体,组蛋白与DNA的结合关系是固定存在的,因此组蛋白的修饰作用成为研究的关键。NaCl可解除组蛋白和DNA的交联关系。

  另一方面,非组蛋白多是参与DNA复制、mRNA转录过程的一些功能蛋白,包括解链酶、切割酶、转录激活蛋白等等,它们与DNA、mRNA的结合关系是瞬时的,发挥完作用可能就及时脱离开了。

  ChIP实验原理:在活细胞状态下,通过甲醛固定DNA-蛋白质复合物后,采用微球菌核酸酶(Micrococcal Nucleas)(注:早期使用的超声已经被淘汰了,不推荐使用)随机切断DNA,形成一个个一定长度范围内的染色质小片段,随后通过抗原-抗体特异性结合反应富集、沉淀这些小片段,然后通过对NaC、蛋白酶K解除蛋白质和DNA的交联,分离蛋白,纯化DNA,最后采用PCR检测DNA的序列信息,获取更多信息。

  从上面的原理就可以看出,ChIP实验步骤大致可分5步:

  (1)1%甲醛处理使蛋白质与 DNA 交联 ;

  (2)细胞裂解,采用微球菌核酸酶消化形成染色质小片段;

  (3)抗原-抗体反应,促进免疫沉淀反应;

  (4)NaCl、蛋白酶 K 处理,解除DNA-蛋白交联;

  (5)DNA 纯化回收;

  (6)采用1.8%琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR对DNA作进一步分析。

  因各试剂商提供的ChIP试剂盒操作参差不齐,因此实验的具体步骤不再展开,大家只需要按照手头上的试剂盒操作说明严格操作即可,但是核心步骤基本符合。接下来的内容主要是注意事项。

  注意事项

  想要做好ChIP实验,必须要控制好6个方面,包括培养基内活细胞数量、交联时间长短、消化后的片段大小、抗体的种类和特异性、常规实验操作技术等多种因素影响 。想要控制这些过程,最核心的就是全面设置对照组。下面逐个做说明。

  1. 活细胞数量

  活细胞计数后,如果最终用于ChIP实验的细胞数量太高,将直接导致甲醛交联时间增加,间接导致细胞数量/微球菌核酸酶比例增大,这些均可造成裂解的DNA小片段过长(超过1000bp),实验处理过程中极易丢失这些片段,最终也会造成PCR检测困难或失败。 最佳的DNA片段长度是150bp-300bp。相反,如果过细胞数量太少,则导致细胞数量/微球菌核酸酶比例减小,最终得到的DNA片段极可能小于100bp。

  总之,你所研究的DNA-蛋白丰度直接决定了ChIP实验所需的细胞数量,没有固定的数量标准,这些都需要预实验充分摸索。

  2. 甲醛交联时间

  1%终浓度的甲醛交联时间推荐5-6分钟。时间过久,会造成裂解的DNA小片段过长(超过1000bp)。时间太短,会导致交联不完全,实验过程中导致一部分的DNA-蛋白质复合物分离,最终分析的结果必然是不准确的。

实验

  3. 设置对照组

  ChIP实验内对照:染色质断裂后,须按一定比例留取部分染色质溶液,此Input DNA(断裂后的基因组DNA)作为ChIP实验的内对照。内对照不仅可以验证染色质断裂的效果。如果按照取样比例换算,还可以根据Input DNA中靶序列的含量和染色质沉淀中的靶序列含量,推算ChIP实验效率,所以Input内对照是必须要设置的。

  阳性抗体对照:目的抗体沉淀DNA-蛋白复合物时,必须需设置阳性抗体对照组。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的、各物种之间比较保守的蛋白抗体,常用组蛋白抗体。

  抗体阴性对照:目的抗体沉淀蛋白DNA复合物时,必须需设置阴性抗体对照组。阴性对照所使用的抗体可以选择目的蛋白抗体宿主的血清蛋白。

  4. 目标蛋白抗体

  ChIP实验中与一般的抗原-抗体免疫反应实验不太一样。

  常规实验如western blot、蛋白质免疫共沉淀等,抗原上只要存在与抗体结合的位点,则二者的免疫反应基本不受到蛋白质空间结构影响。(参见往期内容:①. 全程剖析Western blot原理,你才能掌控它。 ② Co-IP免疫共沉淀 )

  ChIP实验中,染色质沉淀步骤时,蛋白和DNA处在交联状态,目标蛋白的结合位点形成空间阻碍,导致抗体无法与目标蛋白结合形成复合物。 因此,能力够做western blot、蛋白质免疫共沉淀实验的抗体不一定能够做ChIP实验,一定一定要使用已经过ChIP验证的抗体,否则实验必然失败。此外,抗体的浓度、孵育时间、孵育温度需要根据目标蛋白的丰度决定。目标蛋白丰度较低时,可能需要调整活细胞数量、过夜4℃孵育等。

  5. 常规实验操作

  ChIP实验过程较长,过程繁琐,需要反复的洗柱、离心、吸液、换管、孵育、震荡。操作说起来很简单,但是每一步都需要小心操作,非常考验基本功,希望大家多多注意。

  6. 实验结果分析

  对于Input DNA组,采用1.8%琼脂糖凝胶电泳,结果应该是片段集中于150bp到350bp之间,这样长度的DNA片段才是符合要求的。如下:

  进一步,内对照组、阴性抗体对照组、阳性抗体对照组的纯化DNA先采用PCR扩增,随后通过1.8%琼脂糖凝胶电泳,得到的结果应该是这样的:空白对照组无条带、阴性抗体对照组条带若或无、内对照组强条带、阳性对照组看到强条带。只有这样的结果才是成功的。后续才能进行RT-PCR实验。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/624.html

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