PCR清洁试剂盒纯化法

　　方法原理

　　硅胶膜可在高盐条件下结合DNA，又可在低盐条件下与DNA分离。DNA溶液中的引物、单核苷酸、酶、矿物油、盐离子等杂质因为没有与DNA相似的特性，所以被分离开来。

　　实验材料：

　　PCR产物，试剂、试剂盒，PCR清洁试剂盒

　　仪器耗材：

　　96孔DNA制备板、96孔深孔板、96孔V型底板

　　[ 试剂盒组成、贮存、稳定性]

　　耗材：96孔DNA制备板，96孔1.6ml深孔板，96孔V型底板。

　　BufferPCR-A：DNA结合溶液。室温密闭贮存。若出现沉淀，应于65℃温浴溶解并冷却至室温后再使用。

　　BufferW2concentrate：去盐液。使用前，根据瓶上指定的体积加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%无水乙醇

　　Eluent：2.5mMTris-HCl，pH8.5。室温密闭贮存。

　　实验操作

　　A. 负压法

　　正确连接负压装置，将96孔DNA制备板置于负压装置上；

　　在PCR、酶切、酶标或测序反应液中，加3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A不足100ul，加至100ul）；

　　混合均匀后转移到96孔DNA制备板中，开启并调节负压至-25-30英寸汞柱，缓慢吸掉板中溶液。

　　加0.3mlBufferW2，吸尽管中溶液。以同样的方法再用0.3mlBufferW2洗涤两次。

　　保持负压将96孔DNA制备板抽吸10min。

　　导流管朝下将96孔DNA制备板于长纤维性纸巾上用力拍击6次。

　　将96孔DNA制备板置于96孔V型底板上，在膜正中央加25-30ul水或Eluent，室温静置1min。3000xg离心5min，洗脱DNA。

　　*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

　　B. 离心法

　　在PCR、酶切、酶标或测序反应液中，加3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A不足100ul，加至100ul）；

　　混匀后，转移到96孔DNA制备板中，将96孔DNA制备板置于96孔1.6ml深孔板中，1000xg离心1min，弃滤液。

　　在96孔DNA制备板中，加0.3mlBufferW2，1000xg离心1min，弃滤液，以同样的方法再用0.3mlBufferW2洗涤一次。

　　将96孔DNA制备板置于96孔1.6ml深孔板中，3000xg离心10min。

　　将96孔DNA制备板置于洁净的96孔V型底板中，在膜正中央加25-30ul水或Eluent，室温静置1min。3000xg离心5min，洗脱DNA。

　　*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

　　DNA凝胶回收试剂盒纯化法

　　方法原理

　　琼脂糖凝胶在温和的缓冲液(DE-A溶液)中溶解，其中的保护剂能防止线状DNA在高温下降解，然后在DE-B溶液的作用下使DNA选择性结合到膜上。纯化的DNA纯度高，并保持片断完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、PCR扩增、测序、微注射等分子生物学实验。

　　仪器耗材：

　　DNA制备管、2ml离心管、1.5ml离心管

　　[ 试剂盒组成、贮存、稳定性]

　　BufferDE-A：凝胶熔化剂，含DNA保护剂，防止DNA在高温下降解。室温密闭贮存。

　　BufferDE-B：结合液（促使大于70bp的DNA片段选择性结合到DNA制备膜上）。室温密闭贮存。若出现沉淀，于70℃温育溶解并冷却至室温后使用。

　　BufferW1：洗涤液，室温密闭贮存。

　　BufferW2concentrate：去盐液，使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。

　　100%无水乙醇或95%乙醇。

　　Eluent：2.5mMTris-HCl，pH8.5，室温密闭贮存。

　　实验操作

　　在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶（切成细小碎块，勿长时间暴露在紫外灯下，以防损伤DNA），用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。

　　计算凝胶重量（提前记录1.5ml离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100ul体积）。

　　加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热（低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热），间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全熔化（约6-8min）。

　　加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。

　　步骤4-6可以选择负压法或离心法。

　　A.负压法

　　4A.正确连接负压装置，将DNA制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤3中的混合液，转移到制备管中，开启并调节负压至-20-30英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。

　　5A.加0.5mlBufferW1，吸尽管中溶液。

　　6A.加0.7mlBufferW2，吸尽管中溶液。以同样的方法再用0.7mlBufferW2洗涤一次。

　　B.离心法

　　4B.吸取3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml离心管）中，12000xg离心1min。弃滤液。

　　5B.将制备管置回离心管，加0.5mlBufferW1，12000xg离心30s，弃滤液。

　　6B.将制备管置回离心管，加0.7mlBufferW2，12000xg离心30s，弃滤液。（可选步骤）以同样的方法再用0.7mlBufferW2洗涤一次，12,000xg离心1min。

　　7.将制备管置于2ml离心管中，12000xg离心1min。

　　8.将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25-30ul水或Eluent，室温静置1min。12000xg离心1min，洗脱DNA。

　　*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。