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DNA纯化实验方法(纯化dna的常规方法及其原理)

2022-03-21 10:26:53
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  PCR清洁试剂盒纯化法

  方法原理

  硅胶膜可在高盐条件下结合DNA,又可在低盐条件下与DNA分离。DNA溶液中的引物、单核苷酸、酶、矿物油、盐离子等杂质因为没有与DNA相似的特性,所以被分离开来。

  实验材料:

  PCR产物,试剂、试剂盒,PCR清洁试剂盒

  仪器耗材:

  96孔DNA制备板、96孔深孔板、96孔V型底板

  [ 试剂盒组成、贮存、稳定性]

  耗材:96孔DNA制备板,96孔1.6ml深孔板,96孔V型底板。

  BufferPCR-A:DNA结合溶液。室温密闭贮存。若出现沉淀,应于65℃温浴溶解并冷却至室温后再使用。

  BufferW2concentrate:去盐液。使用前,根据瓶上指定的体积加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%无水乙醇

  Eluent:2.5mMTris-HCl,pH8.5。室温密闭贮存。

  实验操作

  A. 负压法

  正确连接负压装置,将96孔DNA制备板置于负压装置上;

  在PCR、酶切、酶标或测序反应液中,加3个体积的BufferPCR-A(若BufferPCR-A不足100ul,加至100ul);

  混合均匀后转移到96孔DNA制备板中,开启并调节负压至-25-30英寸汞柱,缓慢吸掉板中溶液。

  加0.3mlBufferW2,吸尽管中溶液。以同样的方法再用0.3mlBufferW2洗涤两次

  保持负压将96孔DNA制备板抽吸10min

  导流管朝下将96孔DNA制备板于长纤维性纸巾上用力拍击6次

  将96孔DNA制备板置于96孔V型底板上,在膜正中央加25-30ul水或Eluent,室温静置1min3000xg离心5min,洗脱DNA。

  *确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

  B. 离心法

  在PCR、酶切、酶标或测序反应液中,加3个体积的BufferPCR-A(若BufferPCR-A不足100ul,加至100ul);

  混匀后,转移到96孔DNA制备板中,将96孔DNA制备板置于96孔1.6ml深孔板中,1000xg离心1min,弃滤液。

  在96孔DNA制备板中,加0.3mlBufferW2,1000xg离心1min,弃滤液,以同样的方法再用0.3mlBufferW2洗涤一次。

  将96孔DNA制备板置于96孔1.6ml深孔板中,3000xg离心10min

  将96孔DNA制备板置于洁净的96孔V型底板中,在膜正中央加25-30ul水或Eluent,室温静置1min3000xg离心5min,洗脱DNA。

  *确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

  DNA凝胶回收试剂盒纯化法

  方法原理

  琼脂糖凝胶在温和的缓冲液(DE-A溶液)中溶解,其中的保护剂能防止线状DNA在高温下降解,然后在DE-B溶液的作用下使DNA选择性结合到膜上。纯化的DNA纯度高,并保持片断完整性和高生物活性,可直接用于连接、体外转录、PCR扩增、测序、微注射等分子生物学实验。

  仪器耗材:

  DNA制备管、2ml离心管、1.5ml离心管

  [ 试剂盒组成、贮存、稳定性]

  BufferDE-A:凝胶熔化剂,含DNA保护剂,防止DNA在高温下降解。室温密闭贮存。

  BufferDE-B:结合液(促使大于70bp的DNA片段选择性结合到DNA制备膜上)。室温密闭贮存。若出现沉淀,于70℃温育溶解并冷却至室温后使用。

  BufferW1:洗涤液,室温密闭贮存。

  BufferW2concentrate:去盐液,使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。

  100%无水乙醇或95%乙醇。

  Eluent:2.5mMTris-HCl,pH8.5,室温密闭贮存。

  实验操作

  在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶(切成细小碎块,勿长时间暴露在紫外灯下,以防损伤DNA),用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。

  计算凝胶重量(提前记录1.5ml离心管重量),该重量作为一个凝胶体积(如100mg=100ul体积)。

  加入3个凝胶体积的BufferDE-A,混合均匀后于75℃加热低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热),间断混合(每2-3min),直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。

  加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B,混合均匀;当分离的DNA片段小于400bp时,加入1个凝胶体积的异丙醇。

  步骤4-6可以选择负压法或离心法。

  A.负压法

  4A.正确连接负压装置,将DNA制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤3中的混合液,转移到制备管中,开启并调节负压至-20-30英寸汞柱,缓慢吸走管中溶液。

  5A.加0.5mlBufferW1,吸尽管中溶液。

  6A.加0.7mlBufferW2,吸尽管中溶液。以同样的方法再用0.7mlBufferW2洗涤一次。

  B.离心法

  4B.吸取3中的混合液,转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中,12000xg离心1min。弃滤液。

  5B.将制备管置回离心管,加0.5mlBufferW1,12000xg离心30s,弃滤液。

  6B.将制备管置回离心管,加0.7mlBufferW2,12000xg离心30s,弃滤液。(可选步骤)以同样的方法再用0.7mlBufferW2洗涤一次12,000xg离心1min

  7.将制备管置于2ml离心管中,12000xg离心1min

  8.将制备管置于洁净的1.5ml离心管中,在DNA制备膜正中央加25-30ul水或Eluent,室温静置1min12000xg离心1min,洗脱DNA。

  *确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

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