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常见细胞培养污染判别有哪些方法,细胞培养污染判别及应对措施

2023-04-20 10:35:12
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  污染是细胞培养中一个大敌,一旦污染,前功尽弃。 决定要进行细胞培养,首先-定要有强烈的无菌意识,操作中要遵守严格的操作规程,不要怕麻烦,越细心越好。

  一般情况下,如果你的细胞被细菌污染了,培养皿或瓶中的细胞状态很快就会发生变化,表现为胞浆中出现大量的颗粒,液体浑浊、培养基PH下降,变成黄色,贴壁细胞形态变圆、会脱壁死亡;而受到真菌污染的细胞,细胞状态并不会马上发生变化,培养3-4天后,可能才会在培养皿中看到白色的漂浮物或者黑色的小点儿。

  常见细胞培养污染判别

  真菌污染

  真菌种类多,形态各异,但污染后均不难发现,大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面,肉眼可见;有的散在生长,镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝,纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态,散在于细胞周边和细胞之间生长。

  细菌污染

  污染后大多能改变培养液pH培养液变混浊,毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显。

  支原体污染

  支原体(Mycoplasma)是一种没有细胞壁的原核生物,大小约0.3-0.8微米。目前,已发现的支原体品种有100多种。

  细胞培养的支原体污染来源主要有

  (1)细胞之间的交叉污染,这是支原体污染的最主要原因;

  (2)细胞培养操作人员的口腔、皮肤等;

  (3)细胞培养用的组分,如血清、培养液等;

  黑胶虫污染

  黑胶虫可以穿透滤膜,也可以通过空气传播,低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液也是不浑的,一般不会太影响,细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。

  常见细胞培养污染判别及应对措施

  细胞培养中的常见污染主要包括:细菌、霉菌、支原体、黑胶虫、病毒和交叉污染等,每一种污染都有各自的特点。如细菌和霉菌增殖迅速,短时间就对细胞造成明显伤害;而支原体和病毒对细胞的影响则是一种缓慢长期的过程。下面就具体看看每一种污染。

  1. 细菌污染(较容易被发现)

  引起原因:操作不规范或无菌措施不到位等;

  细菌污染种类:白色葡萄球菌,大肠杆菌,假单孢菌、枯草杆菌等;

  细胞污染后的变化

  ①污染后由于有大量酸性物质产生,因此培养基会短时间内由红色变为黄色;

  ②由于细菌大量增殖,培养基变浑浊,稍微振荡后可见培养基表面有漂浮物;

  ③普通倒置显微镜高倍镜观察,胞浆内可见大量颗粒(如下图红色箭头);

  ④细胞生长缓慢,逐渐变圆脱落。

  如下图所示:左:悬浮细胞污染后,可见悬浮细胞个体远大于杆状细菌,而细菌呈黑色颗粒状并会有较快的运动速度;右:贴壁细胞,可看到球状细菌分布于细胞周围并做剧烈运动。

图例

  细菌污染的细胞(左悬浮细胞,右贴壁细胞)

  处理措施

  在培养液中添加双抗(P/S)处理;可用抗生素的常用量的5~10倍作冲击疗法,用药24~48h后再换常规培养液;

  另外添加西司他丁钠和亚胺培南(泰能)处理细胞,适用于培养用具被打翻、使用了污染的培养液或要培养污染的组织或者冻存细胞的污染情况[1]。

  裸鼠体内接种法是比较有效和彻底的除菌方法。主要包括腹水接种和皮下荷瘤分离细胞。既能彻底清除污染细菌,又能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。对于一些特别珍贵的肿瘤细胞,可采用裸鼠体内接种法[2]。

  2. 霉菌污染(较容易被发现)

  引起原因:操作不规范或无菌措施不到位等;

  污染种类:白色念珠菌,酵母菌,黑霉菌,曲霉菌,孢子菌等;

  细胞污染后的变化

  ①一般来说,培养液不会变浑浊;

  ②比较容易发现,肉眼可见点状菌落(淡黄色或者白色)漂浮在培养基表面(如下图左);

  ③普通倒置显微镜下观察,可见絮状交错的菌丝或菌团生长在细胞之间;有时真菌并不是直接分布于细胞贴壁层,需要通过调整显微镜仔细观察寻找菌丝或菌团(如下图右)。

  如下图所示:悬浮细胞U397的霉菌污染,黄色圆形发亮的是U397;红色箭头:霉菌的菌丝和孢子囊,特别的是孢子释放出来后是难以被酒精杀死。

图例

  霉菌污染后的悬浮细胞

  处理措施

  添加制霉菌素和两性霉素B,但是对细胞的毒性也较大;

  环境彻底消毒:先后用酒精、新洁尔擦洗培养箱;水盘加上饱和量的硫酸铜。

  若细胞不是特别珍贵,建议丢弃。

  3. 支原体污染(难被发现)

  支原体是一种自然界中能独立生活的最小微生物,能通过细菌滤器,在细胞培养过程中,支原体感染发生率很高[3]。由于支原体可以与细胞共存,生长速率受影响较小,而被忽视。支原体污染在细胞培养污染中最为隐蔽和最难察觉,但是支原体能明显影响宿主细胞代谢、RNA合成及基因表达的作用,因此越来越受到重视。

  引起原因:主要来源于是已感染支原体细胞之间的交叉污染,支原体感染的血清和胰酶等;

  细胞污染后的变化

  ①培养液不变浑浊,但会很快变成黄色;

  ②多数细胞在形态方面少有明显变化;

  ③在倒置显微镜下可见胞浆出现小颗粒或空泡;

  如下图:支原体个体很小,需要使用透射电镜才能清晰看到其结构及分布,图中红色箭头即为支原体,其分布在细胞周围。

图例

  支原体污染后的透射电镜图[4]

  处理措施

  定期用支原体试剂盒检测;

  换液可以减缓污染情况,但无法根除;

  支原体清除试剂盒可以达到较好效果;

  小鼠腹腔巨噬细胞清除法。

  4. 黑胶虫污染

  引起原因:往往来源于血清;

  细胞污染后的变化

  ①低倍镜下观察时可见黑色小点,高倍镜下可见到其做布朗运动,像小虫游来游去;

  ②细胞培养液仍然清亮,污染较轻时对细胞无影响;若太多就会对细胞造成影响。

  如下图:红色箭头所示黑胶虫分布于细胞间。

图例

  黑胶虫污染后的细胞[5]

  处理措施

  更换血清;增加细胞密度,提高细胞的生长率。

  5. 病毒污染

  引起原因:病毒可能来自于血清;

  细胞污染后的变化

  ①污染后培养液无明显变化;

  ②大部分细胞也不会有明显的形态变化;

  6. 交叉污染

  引起原因:两种或两种细胞以上的实验同时进行,实验器具、试剂等混用而易造成的污染;

  检测手段:可通过镜检观察细胞形态是否与所培养细胞形态一致来判断,另外还可以通过各种免疫学试验、同功酶分析及细胞遗传学方法来确定。

  处理方式:针对病毒和交叉污染较难清除,建议丢弃细胞重新培养;

  看到这里,文章开头的那几张图片代表着什么污染,你能辨别了吗?可以在下方给我们留言,看看你是否掌握了这项技能哦!

  学会对各种污染情况的辨别和处理是一项不可或缺的实验技能,希望大家在看完我们的文章后结合你的实验操作,学会如何应对细胞污染。

  参考文献

  1.江千里, 王健民, 江汕,等. 西司他丁钠+亚胺培南消除细胞培养中细菌污染的研究[J]. 第二军医大学学报, 2004, 25(1):114-115.

  2.王鸿、张伟、孟娜. 细胞培养中珍贵贴壁细胞污染挽救方法的评价[J]. 首都医科大学学报, 2011,26 (1):1006-7795.

  3.Olareringeorge A O, Hogenesch J B. Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI's RNA-seq archive[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(5): 2535-2542.

  4.Shlomo R, Nechama S K, Jonathan D K,. Contamination of Tissue Cultures by Mycoplasmas. DOI: 10.5772/51518

  5.辛颜彬.细胞培养污染的发生、预防及清除[J].军事医学科学院院刊,1989,13( 6):468-470.

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