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Northern Blot原理及实验方法(诺瑟杂交方法及步骤)

发布时间:2022-03-20 10:32:00 阅读:11652次 来源:舆舟佐研网

  实验原理及用途

  原理:在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的RNA探针进行反应。

  用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。

  用具准备

  180度烤器皿:三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。

  电泳槽:清洗梳子和电泳槽,并用双氧水浸泡过夜,用DEPC水冲洗,干燥备用。

  处理DEPC水(2L)备用。

  用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子,电泳槽,刀片等,然后用DEPC水冲洗二次,去除RNAZap。

  制胶

  称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中,加入32.4mlDEPC水后,微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分)

  在通风厨中加入3.6ml的10*DenaturingGelbuffer,轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。

  将熔胶倒入制胶板中,插上梳子如果胶溶液上存在气泡,可以用热的玻璃棒去除,或将气泡推到胶的边缘。注:胶的厚度不能超过0.5cm。

  胶在室温下完全凝固后,将胶转移到电泳槽中,加入1xMOPSGelRunningbuffer盖过胶面约1cm,小心拔出梳子。(配制250ml1×MOPSGelRunningbuffer,在电泳过程中补充蒸发的buffer),并检查点样孔。

  RNA样品的制备

  在RNA样品中加入3倍体积的formaldehydeloaddye和适当的EB(终浓度为10ug/ml)。混匀后,65℃空气浴15min。

  短暂低速离心后,立即放置于冰上5min。

  电泳

  将RNA样品小心加到点样孔中。

  在5V/cm下跑胶(5x14cm)。电泳过程中,每隔30min短暂停止电泳,取出胶,混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝(500bp)接近胶的边缘时终止电泳。

  紫外灯下,检验电泳情况,并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

  探针的制备

  在1.5ml离心管中配制以下反应液:模板DNA(25ng)、1ulRandomPrimer2ul灭菌水11ul总体积:14ul

  95°C加热3分钟后,迅速放置于冰冷却5min。

  在离心管中按下列顺序加入以下溶液:10×Buffer2.5ul、dNTPMixture2.5ul、111TBq/mmol[a-32P]dCTP5ul、Exo-freeKlenowFragment1ul

  混匀后(25ul),37°C下反应30分钟。短暂离心,收集溶液到管底。

  65°C加热5min使酶失活。

  探针的纯化及比活性测定

  准备凝胶:将1g凝胶加入30ml的DEPC水中,浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次,以除去可溶解的葡聚糖。

  取1ml一次性注射器,去除内芯推扞,将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住,在注射器中装填SephadexG-50凝胶。

  将注射器放入一支15ml离心管中,注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟,凝胶压紧后,补加SephadexG-50凝胶悬液,重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处

  100ulSTE缓冲液洗柱,1600g离心4min。重复3次。

  倒掉离心管中的溶液后,将去盖的1.5ml离心管置于管中,再将装填了SephadexG-50凝胶的注射器插入离心管中,注射器口对准1.5ml离心管。

  将标记的DNA样品加入25ulSTE,取出0.5ul点样于DE8 paper上,其余上样于层析柱上。

  1600g离心4min,DNA将流出被收集在去盖的离心管中,而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper,测比活性。

  预杂交

  将预杂交液在杂交炉中68℃预热,并漩涡使未溶解的物质溶解。

  加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm²膜面积加入10mlULRAhyb杂交液),42℃预杂交4h。

  探针变性

  90℃热处理稀释后探针10min后,立即放置于冰上5min。

  短暂离心,将溶液收集到管底。

  杂交

  加入0.5mlULTRAhyb到变性的探针中,混匀后,将探针加到预杂交液中。

  42℃杂交过夜(14~24hr)。杂交完后,将杂交液收集起来于-20℃保存。

  洗膜

  低严紧性洗膜:加入LowStringencyWashSolution#1(100cm²膜面积加入20ml洗膜溶液),室温下,摇动洗膜5min两次。

  高严紧性洗膜:加入HighStringencyWashSolution#2(100cm²膜面积加入20ml洗膜溶液),42℃摇动洗膜20min两次。

  曝光

  将膜从洗膜液中取出,用保鲜膜包住,以防止膜干燥。

  检查膜上放射性强度,估计曝光时间

  将X光底片覆盖与膜上,曝光

  冲洗X光底片,扫描记录结果。

  去除膜上的探针

  将200ml0.1%SDS(由DEPC水配制)煮沸后,将膜放入,室温下让SDS冷却到室温,取出膜,去除多余的液体,干燥后,可以保存几个月。

  注意事项

  操作应该小心,但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse酶,以免样品的降解。转膜时,注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/941.html

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