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细胞划痕传统实验方法(细胞划痕实验结果与分析)

发布时间:2022-08-22 10:26:07 阅读:19242次 来源:百度学术

  细胞划痕实验(Wound Healing)是一种操作简单,经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外实验方法。这种方法的原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上划痕工具制造一个空白区域,空白区域的细胞被机械力去除掉了,通过一段时间的培养,观察细胞向无细胞区域迁移的情况,通过测量细胞的迁移距反映细胞的迁移能力。

细胞划痕实验

  细胞划痕实验的用途及优点

  用途:肿瘤细胞运动常用研究方法。这种方法的原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。基本的步骤包括“划痕”的制造,细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。

图例

  细胞划痕实验结果与分析

  优点:

  1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。

  2.非常适合研究细胞与胞外基质(ECM),细胞与细胞之间相互作用引起的细胞 迁移。

  3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容,可用于分析细胞间的相互作用。

  4.研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。

  Culture Insert方法

  1.准备细胞,培养液,culture Insert。

  2.如图,将细胞接种于Dish中间的Insert,细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500μm宽度的划痕。

  3.每隔4-6小时拍照记录。

  4.根据收集图片数据分析实验结果。

细胞划痕实验

  传统实验方法

  实验材料:

  1.细胞培养平板,一般使用 6 孔板,大小合适,便于划线和观察;

  2.marker 笔,用于观察是标记;

  3.直尺,用于观察时对细胞划痕宽度测量;

  4.20 微升枪头(灭菌)或者经过灭菌处理的牙签均可,用于在单层细胞上划痕;

  5.无血清培养基;

  6.PBS。

  注:所有能灭菌的器械都要灭菌,直尺和marker笔在操作前紫外照射30min(超净台内)

  实验步骤:

  1.培养板划线

  首先使用 marker 笔在 6 孔板背后,用直尺比着,均匀的划横线,大约每隔 0.5~1cm 一道,横穿过孔。每孔至少穿过 5 条线。划线时注意线不要太粗 。

  2.铺细胞

  在孔中加入约 5×105 个细胞(不同的细胞数量有所不同,根据细胞的生长快慢调整),接种原则为过夜后融合率达到 100%。

  3.细胞划线

  第二天用枪头或者无菌牙签,垂直与细胞平面,沿着头一天划在平板背面的线在细胞层上进行划痕(不同孔之间最好使用同一只枪头或牙签)。

  4.洗细胞

  划痕完成后,使用无菌 PBS 洗细胞 3 次,洗去不贴壁的细胞,即划线时划线的细胞,是划线后留下的间隙清晰可见,然后更换新鲜无血清培养基。

  5.细胞培养、观察

  将细胞放入 37℃ 5% CO2培养箱,培养。然后在适当的时间点,如 0,6,12,24h 取出细胞,显微镜线观察并测量划痕的宽度,并拍照(具体时间依实验需要而定)。

  6.结果分析

  使用 Image J 软件打开图片后,随机划取 6 至8 条水平线,计算细胞间距离的均值。

细胞划痕实验

  注:1、实验时,选择适当的细胞贴壁率;2、划线后,通常采用无血清或低血清( < 2%)的培养液。

  注意事项

  1.铺细胞最好使用 6 孔板,因为 6 孔板可以保证有相当距离的平直划痕,而且因为有5 条定位线,与划痕相交,这样就有 10 个可固定监测点,不作重复,误差也很小。

  2.如果你连续监测 24 小时,你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果,而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移,你可以先用丝裂霉素(1 μg/ml)处理一小时,抑制细胞的分裂,这样你的结果就是细胞迁移的作用了。另外,使用无血清培养基也可以降低增殖对实验结果的影响。

  3.照片拍完之后,可以用 image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。

  4.虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响,但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节,细胞迁移的速度也会慢很多。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1504.html

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