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精准医疗:基因敲除与敲入系统(CRISPR-Cas9应用)

发布时间:2021-10-13 05:51:20 阅读:14632次 来源:本站

  对于我们研究人员来说,比较关心的是,目前CRISPR/Cas9基因编辑技术有哪些成功的技术应用?这些技术又如何应用到实验中?本篇文章主要从实验原理、实验流程步骤,两方面来介绍CRISPR-Cas9基因敲除系统(knockout)和CRISPR-Cas9基因敲入系统(knock in)

  CRISPR-Cas9基因敲除系统

  实验流程:

  1.设计sgRNA

  2.构建sgRNA-Cas9载体

  3.构建sgRNA-Cas9稳转株

  4 .筛细胞克隆并进行qPCR验证

  5 .阳性克隆测序,选择敲除純合细胞株

  6 .筛选细胞单克隆测序

  实验步骤:

  1、设计sgRNA

  针对小鼠LIF基因座(Musmusculus,NM_008501)设计了三种sgRNA。进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。

  2、构建sgRNA-Cas9载体

  然后将选择的sgRNA设计克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-Onelentivector中(图1)

 sgRNA-Cas9载体图谱

图 sgRNA-Cas9载体图谱

  3、构建sgRNA-Cas9稳转株

  利用慢病毒包装体系构建sgRNA-Cas9稳转株,进行嘌呤筛选

  4、 筛细胞克隆并进行qPCR验证

  嘌呤霉素筛选后分离细胞克隆。提取基因组DNA并进行验证测定目的基因座是否进行编辑

  在野生型(WT)测定中的单个条带表示没有发生编辑; 两个较小的条带(总和WT的长度)表示编辑已经发生。图2表明,克隆 3和6编辑; 克隆2没有编辑; 克隆1是不确定的。

  5、 阳性克隆测序,选择突变细胞株

  通过Sanger测序进一步分析细胞集落3和6的PCR产物以确定敲除的性质(图3)。

  对于细胞集落3,只检测到一个突变序列,表明这些细胞可能只是杂合敲除。在菌落6中检测到两种不同的突变序列。

  6、 筛选细胞选择单克隆纯合突变细胞株

  将菌落6连续稀释到96孔板中进行单克隆选择。从这些克隆(即6a,6b ..)中提取基因组DNA,进行PCR扩增,克隆和测序。

  测序显示,在两个等位基因中只有克隆6a具有移码突变(图4)。移码突变破坏了开放阅读框架,导致无意义介导的mRNA。

  7、进一步测序,确定純合突变

基因组测序结果

图 细胞基因组测序结果

  CRISPR-Cas9基因敲入系统(knock in)

  实验原理:

  CRISPR-Cas9基因敲入系统是Cas9内切酶切割双链DNA,且有一段高度同源的DNA修复模板存在的情况下,生物体内启动HDR修复路径,将一段外源DNA定点插入基因内部。

  同源性定向修复(HDR)途径,对比NHEJ修复途径,同源性定向修复(HDR)途径是更为精确的修复机制。这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。在该修复路径中,需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。

  在高度同源性DNA模板存在的情况下, HDR机制可以通过同源重组将一段DNA插入编辑位点(图4)。这种修复方式可以将一段DNA序列精准地插入特定的基因组位点。

  实验流程:

  1 .设计sgRNA-Cas9及修复DNA模版

  2 .构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒

  3 .将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞

  4 .嘌呤筛选,检测荧光

  5 .PCR检测基因组,RFP蛋白是否敲入

  实验步骤:

  1 设计sgRNA及修复DNA模版

  针对人类AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因设计了sgRNA进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。设计DNA修复模版,两侧同源臂,其两侧各有600bp的同源臂。

  2 构建sgRNA质粒及修复DNA模板质粒

  将选定的sgRNA设计与CMV启动子驱动的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制备pCas-Guide-AAVS1。

  将DNA修复模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表达载体。

  3 将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞

  用lipofectmine2000转染试剂将上述两种质粒转染至293T细胞。

  4 嘌呤筛选,检测荧光

  嘌呤筛选3-4周

  3-4周后,> 95%的HEK293细胞表达RFP(图3)。

荧光

图 荧光检测图片

  A转染筛选后明场图片  B转染筛选后荧光图片 C未转染加嘌呤筛选细胞

  5 PCR检测基因组,RFP蛋白是否敲入

  为了证实在基因组DNA中敲入RFP,设计引物对,引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因内的引物2。

  1.1kb的PCR产物表明在AAVS1位点敲入成功; 没有PCR扩增指示敲入不成功(图4)。

基因

  图  PCR产物检测,在对照细胞('WT细胞')中没有看到PCR扩增。

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本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/274.html

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