对于我们研究人员来说，比较关心的是，目前CRISPR/Cas9基因编辑技术有哪些成功的技术应用？这些技术又如何应用到实验中？本篇文章主要从实验原理、实验流程步骤，两方面来介绍CRISPR-Cas9基因敲除系统（knockout）和CRISPR-Cas9基因敲入系统（knock in）

　　CRISPR-Cas9基因敲除系统

　　实验流程：

　　1.设计sgRNA

　　2.构建sgRNA-Cas9载体

　　3.构建sgRNA-Cas9稳转株

　　4 .筛细胞克隆并进行qPCR验证

　　5 .阳性克隆测序，选择敲除純合细胞株

　　6 .筛选细胞单克隆测序

　　实验步骤：

　　1、设计sgRNA

　　针对小鼠LIF基因座（Musmusculus，NM_008501）设计了三种sgRNA。进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。

　　2、构建sgRNA-Cas9载体

　　然后将选择的sgRNA设计克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-Onelentivector中（图1）

图 sgRNA-Cas9载体图谱

　　3、构建sgRNA-Cas9稳转株

　　利用慢病毒包装体系构建sgRNA-Cas9稳转株，进行嘌呤筛选

　　4、 筛细胞克隆并进行qPCR验证

　　嘌呤霉素筛选后分离细胞克隆。提取基因组DNA并进行验证测定目的基因座是否进行编辑

　　在野生型（WT）测定中的单个条带表示没有发生编辑; 两个较小的条带（总和WT的长度）表示编辑已经发生。图2表明，克隆 3和6编辑; 克隆2没有编辑; 克隆1是不确定的。

　　5、 阳性克隆测序，选择突变细胞株

　　通过Sanger测序进一步分析细胞集落3和6的PCR产物以确定敲除的性质（图3）。

　　对于细胞集落3，只检测到一个突变序列，表明这些细胞可能只是杂合敲除。在菌落6中检测到两种不同的突变序列。

　　6、 筛选细胞选择单克隆纯合突变细胞株

　　将菌落6连续稀释到96孔板中进行单克隆选择。从这些克隆（即6a，6b ..）中提取基因组DNA，进行PCR扩增，克隆和测序。

　　测序显示，在两个等位基因中只有克隆6a具有移码突变（图4）。移码突变破坏了开放阅读框架，导致无意义介导的mRNA。

　　7、进一步测序，确定純合突变

图 细胞基因组测序结果

　　CRISPR-Cas9基因敲入系统（knock in）

　　实验原理：

　　CRISPR-Cas9基因敲入系统是Cas9内切酶切割双链DNA，且有一段高度同源的DNA修复模板存在的情况下，生物体内启动HDR修复路径，将一段外源DNA定点插入基因内部。

　　同源性定向修复（HDR）途径，对比NHEJ修复途径，同源性定向修复（HDR）途径是更为精确的修复机制。这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。

　　在高度同源性DNA模板存在的情况下， HDR机制可以通过同源重组将一段DNA插入编辑位点（图4）。这种修复方式可以将一段DNA序列精准地插入特定的基因组位点。

　　实验流程：

　　1 .设计sgRNA-Cas9及修复DNA模版

　　2 .构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒

　　3 .将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞

　　4 .嘌呤筛选，检测荧光

　　5 .PCR检测基因组，RFP蛋白是否敲入

　　实验步骤：

　　1 设计sgRNA及修复DNA模版

　　针对人类AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因设计了sgRNA进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。设计DNA修复模版，两侧同源臂，其两侧各有600bp的同源臂。

　　2 构建sgRNA质粒及修复DNA模板质粒

　　将选定的sgRNA设计与CMV启动子驱动的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制备pCas-Guide-AAVS1。

　　将DNA修复模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表达载体。

　　3 将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞

　　用lipofectmine2000转染试剂将上述两种质粒转染至293T细胞。

　　4 嘌呤筛选，检测荧光

　　嘌呤筛选3-4周

　　3-4周后，> 95％的HEK293细胞表达RFP（图3）。

图 荧光检测图片

　　A转染筛选后明场图片  B转染筛选后荧光图片 C未转染加嘌呤筛选细胞

　　5 PCR检测基因组，RFP蛋白是否敲入

　　为了证实在基因组DNA中敲入RFP，设计引物对，引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因内的引物2。

　　1.1kb的PCR产物表明在AAVS1位点敲入成功; 没有PCR扩增指示敲入不成功（图4）。

　　图  PCR产物检测，在对照细胞（'WT细胞'）中没有看到PCR扩增。

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