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细胞的复苏实验操作步骤

2023-06-29 10:23:27
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  非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中,需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。细胞复苏的原则——快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。

  具体操作如下:

  1、实验前准备:

  将水浴锅预热至37℃,并将含10%FBS的培养液置于其中预热。用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

  2、取出冻存管及迅速解冻:

  根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化,约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。

  3、平衡离心 将细胞悬液吸到离心管中,1000~1500rpm离心3分钟;

  4、制备细胞悬液 吸去上清液,加入10 ml培养液,用吸管轻轻吹打均匀,使细胞悬浮;

  5、细胞计数 细胞浓度以5×105/ml为宜。

  6、培养细胞 将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内培养(略微拧松培养瓶盖),换液的时间由细胞情况而定。通常,除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 可直接放入含有10-15ml(5-10倍)新鲜培养基的培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。


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