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细胞的传代实验操作步骤

2023-06-30 10:31:39
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  培养的细胞生长至一定密度之后,由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累(可见到培养液变黄),而且细胞的生长空间也受到限制,就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液,这一过程就叫做传代。

  1、贴壁细胞的传代

  具体操作如下:

  1.1、传代前准备:

  预热培养用液:把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。用75%酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台。正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。点燃酒精灯:注意火焰不能太小。准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。从培养箱内取出细胞,注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞,并做好记录。细胞培养瓶经用75%酒精擦拭后,再放入超净台。

  1.2、胰蛋白酶消化:

  将瓶盖过酒精灯火焰消毒后,打开瓶盖,靠近酒精灯,小心吸出旧培养液,用PBS清洗2-3次,沿壁(无细胞的一面)缓缓加入适量消化液(胰蛋白酶液),轻轻摇晃。注意消化液的量以盖住细胞Z好,Z佳消化温度是37℃。显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。

  1.3、吹打分散细胞:

  弃去大部分消化液(仅留少量在瓶内),并轻轻拍打培养瓶,使细胞分散,然后加入新鲜的培养液,

  再用吸管轻轻吹打成细胞悬液(尽可能不要出现泡沫,否则对细胞有损伤〕

  1.4、分装稀释细胞

  将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。将培养基放入显微镜下观察细胞量,必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。Z后在瓶上做好标记,如细胞代数、日期及姓名等。

  1.5、继续培养:

  用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在

  瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。

  2、悬浮细胞的传代

  悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉,只留下少量,然后加入新鲜培养液即可。 当细胞悬液中碎片或颗粒物较多,感觉到比较脏时,可以将悬液移到离心管内,1000~1500rpm离心3分钟,弃上清,加入约2ml培养液,吹打至均匀,滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱中培养(拧松培养瓶盖)。

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