细胞是生命体系中最基本的单位，对于科学研究和医学应用有着重要的意义。然而，由于细胞易受到外部环境、温度变化等因素影响，很容易失活或死亡。冷冻保存细胞是目前较为常见的一种保护细胞的方法。在本文中，我将详细介绍冷冻保存细胞的方法及注意事项。

　　1. 细胞冷冻保存的原理

　　细胞冷冻保存的原理是将细胞放入低温条件下，减缓代谢过程，从而降低细胞死亡率。冷冻可以使细胞在长时间内存活，因此被广泛应用于生物技术、医学、农业等领域。

　　2. 细胞冷冻保存的方法

　　2.1 冷冻液的选择

　　细胞冷冻液的主要作用是保持细胞的稳定性和避免冷冻过程中细胞受损。经常使用的冷冻液包括DMSO（二甲基亚砜）、甘油、酪蛋白羟化物等。其中最常用的是DMSO，它可以渗透细胞膜，保护细胞内部结构和代谢功能。

　　2.2 冷冻保存的步骤

　　步骤一：生长期的细胞收集

　　当要冷冻保存某种细胞时，首先需要将处于生长期的细胞收集起来。一般情况下，应该使用无菌操作技术，以避免污染。

　　步骤二：细胞处理

　　接下来，将细胞用PBS等缓冲液洗涤一遍，以去除培养基、血清、抗生素等成分。然后，将细胞用1mL冷冻液悬浮，将混合物均匀地装入冻存管中，封闭管盖，标记好样品信息。

　　步骤三：细胞冷冻

　　将装有细胞混合物的冻存管放入低温环境中进行冷冻。冷冻的速度要越快越好，可采用在-80℃冰箱中直接冷冻或用液氮进行快速冷冻。冷冻过程中要注意避免管子破裂或样品受到震荡等。

　　2.3 细胞冷冻保存的注意事项

　　注意事项一：细胞数目不宜过多

　　一般来说，每个冻存管中含有1×106 ~ 1×107个细胞比较适宜。如果太多，则会导致细胞之间的相互作用增强，容易发生凝集，从而影响细胞的恢复率。

　　注意事项二：冷冻液的浓度

　　冷冻液的浓度越高，细胞在冷冻过程中受到的伤害就越小，但是浓度过高也会对细胞产生损害。一般来说，冷冻液的浓度应该在5% ~ 20%之间。对于不同类型的细胞，其所需的最佳浓度也不尽相同。

　　注意事项三：冷冻管的选择

　　应该选择质量好、无缺陷、耐寒性强的冷冻管，并且要保证管子能够完全密封，以避免细胞受到空气氧化和污染。

　　注意事项四：细胞保存温度

　　细胞冷冻后应该存放在-80℃或液氮中，以延缓细胞代谢过程。需要注意的是，每次取出冷冻管时都应该在-80℃或液氮中迅速取出并使用，以减少细胞受到的损伤。

　　3. 细胞冷冻保存的恢复

　　想要成功恢复冷冻保存的细胞，需要进行以下步骤：

　　将冷冻管快速放入37℃的水浴中，使冰晶迅速融化；

　　将混合物转移到离心管中，加入适当的培养基；

　　离心沉淀后，去除上清液；

　　重新悬浮细胞，将其接种到培养皿中；

　　在适宜的温度和CO2浓度下进行培养。

　　4. 结语

　　细胞冷冻保存是一种有效的保护细胞的方法，在生物技术、医学、农业等领域都有着广泛的应用。在进行细胞冷冻保存时，需要注意选择适当的冷冻液、管子等，并遵循正确的操作步骤。只有这样，才能保证细胞的存活率和恢复率，为后续的研究和应用奠定基础。