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植物细胞培养操作方法

2023-06-12 10:22:28
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  植物细胞培养是一项重要的生物技术,可以用于研究植物生长发育、次生代谢产物等方面,同时也是制备植物种质资源和生产植物材料的重要手段。本文将介绍主要的植物细胞培养方法

  一、从外植体分离植物细胞

  1、选择适当生长期的健康植株。

  2、对外植体消毒处理

  (1)冲刷材料;,用流水几分钟—数小时

  (2)表面浸润灭菌;超净台70%酒精10-30S

  (3)深层灭菌; 氯化汞 次氯酸钠

  (4)无菌水冲洗。 3min/次3-10次

  二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞

  获得愈伤组织后,挑选质量好的愈伤组织块,用无菊的镊子或小刀分割得到植物小细胞团,也可以将愈伤组织转移到液体培养基中,加入经过灭菌处理的玻璃珠,进行振荡培养,使愈伤组织分散成为小细胞团或单细朐,然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤,除去大细胞团和残渣,得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。

  三、细胞培养

  1、悬浮细胞培养

  悬浮培养是细胞培养的基本方法,是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。悬浮细胞样本的选择要求为松散性好,增殖快,再生能力强。

  2、悬浮细胞培养同步化

  植物细胞在悬浮培养中的游离性较差,容易团聚进入不同程度的分化状态,因此要达到完全同步化相当困难。可通过以下四个方法使其同步化:

  (1)体积选择法:通过细胞体积大小分级,直接将处于相同周期的细胞进行分选,然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。

  (2)饥饿法:在一个培养体系中,如果细胞生长的基本成分丧失,则导致细胞因饥饿而分裂受阻,从而停留在某一分裂时期。

  (3)抑制法:通过一些DNA合成抑制剂处理细胞,使细胞滞留在DNA合成前期,当解除抑制后,即可获得处于同一细胞周期的同步化细胞。

  (4)低温法:冷处理也可提高培养体系中细胞同步化程度。

  3、单细胞培养

  在进行细胞株(种子细胞)选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下,必须进行真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性,单细胞培养还比较困难,而悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析,也就不能进行定点选择。主要包括以下三种培养方法:

  (1)平板培养

  l 平板培养是将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术主要步骤为:

  l 单细胞的分离:用于平板培养的小细胞团不能超过6个细胞,所以过滤时筛网的网孔大小要合适。

  l 单细胞悬浮液的制备:分离的单细胞经低速离心,培养液洗涤2次后,调整密度为5x105/ml。

  l 植板:将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀,然后均匀地平铺于培养皿中,厚度约1~2mm。

  l 封口:用石蜡膜封培养皿。

  (2)看护培养

  看护培养是指在固体培养基上置入一块活跃生长的愈组织,再在愈伤组织上放一小片滤纸,待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微小细胞团以后,将其直接转至琼脂培养基上让其迅速生长

  (3)微室培养

  人工制造一个小室,将单细胞培养在小室中的少量培养基上,使其分裂增殖形成细胞团。它可对单细胞进行活体连续观察,这一方法也可用于原生质体培养观察细胞壁的再生和细胞分裂过程。

  4、原生质体培养

  原生质体具有全能性、无细胞壁障碍、吸收能力强、分泌能力高、可进行细胞融合等特点。操作步骤主要是:

  l 基础材料准备

  l 预处理与酶解(或机械破壁)

  l 原生质体收集与纯化

  l 原生质体活力测定

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