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冻存细胞的方法及操作步骤

2023-05-17 10:36:03
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  一、资料

  (一)仪器1.净化作业台2.离心机3.恒温水浴箱4.冰箱(4℃、-20℃、-70℃)5.倒置相差显微镜6.培育箱7.液氮冰箱

  (二)玻璃器皿1.吸管(弯头、直头)2.培育瓶3.玻璃瓶(250ml、100ml)4.废液缸

  (三)塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.移液管(10ml)5.15ml离心管6.冻存管(1~2ml)

  (四)别的物品1.微量加样枪2.红血球计数板3.记号笔4.医用橡皮膏5.移液枪

  (五)试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.培育液4.双抗(青霉素、链霉素)5.胰蛋白酶(0.08%)6.1NHCl7.7.4%NaHCO38.DMSO(剖析纯)或无色新鲜甘油

  二、操作过程

  (一)细胞冻存

  1.制造含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培育液;

  2.取对数成长,期的细胞,用胰蛋白酶把单层成长的细胞消化下来,悬浮成长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、;

  3.离心1000rpm,5min;

  4.去掉胰蛋白酶及旧的培育液,参加适当制造好的冻存培育液,用吸管悄悄吹打使细胞均匀,计数,调理冻存液中细胞的终密度为5×106/ml~1×107/ml;

  5.将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5ml;

  6.在冻存管上标明细胞的称号,冻存时间及操作者;

  7.冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。

  (二)细胞复苏

  1.从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快消融。

  2.从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培育液,混匀;

  3.离心,1000rpm,5min;

  4.弃去上清液,参加含10%小牛血清培育液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培育瓶,37℃培育箱静置培育;

  5.次日更换一次培育液,持续培育。

  三、注意事项

  1.从增殖期到构成细密的单层细胞曾经的培育细胞都可以用于冻存,但好为对数成长,期细胞。在冻存**好换一次培育液;

  2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护作业,避免**;

  3.冻存和复苏好用新制造的培育液。


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