流式细胞术检测细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI 双染法）

　　一、原理

　　1、Annexin V-FITC

　　在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞早期凋亡的发生。

　　2、PI

　　碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

　　3、总结

　　因此，将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

　　二、结果分析

　　在二维散点图上，Annexin V是X轴，PI是Y轴，十字门将图片分为四个象限。X轴及Y轴的数值表示的是荧光信号强度或散射光信号相对强度，因此可以将其染色划分为阳性和阴性。其中根据Annexin V染色分为左右两部分，右侧（Q2/3）为Annexin V染色阳性；根据PI染色分为上下两部分，上方（Q1/2）为PI染色阳性。一般认为Annexin V单染的细胞是凋亡早期的细胞，PI单染的细胞是已经死亡的细胞，而双染是凋亡中期的。

　　左上象限Q1：(Annexin V-FITC)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。

　　右上象限Q2：(Annexin V-FITC)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。

　　右下象限Q3：(Annexin V-FITC)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。

　　左下象限Q4：(Annexin V-FITC)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。

　　细胞凋亡率：Q2与Q3象限百分率的和。