传代培养操作步骤

　　1 贴壁培养

　　细胞传代培养操作步骤如下：

　　（1）传代前在倒置显微镜下观察细胞形态和生长密度，当细胞生长密度达到80%~90%时，即可进行传代。

　　（2）吸掉或倒掉培养瓶内的培养液。加入PBS清洗1~2次，左右轻轻摇晃后弃掉。

　　（3）根据培养瓶大小向瓶内加入适量含EDTA的胰蛋白酶，一般应覆盖整个培养瓶底。

　　（4）把培养瓶放入37℃ CO2培养箱进行消化，2~5min后拿出放在倒置显微镜下进行观察，当发现有70%~80%细胞收缩变圆、细胞间隙变大时，再轻轻拍打培养瓶使剩余细胞脱落，然后立即加入2倍胰蛋白酶量的培养液中止消化，使用吸头轻轻吹打，混合均匀，以防消化过度。

　　（5）吸出所有细胞悬液至离心管内，1000rpm/min离心3~5min。

　　（6）弃上清，加入适量培养液重悬细胞，轻轻吹打混匀，使细胞均匀分散。

　　（7）用吸头吸取适量细胞悬液，以适宜的密度接种于新的培养瓶中，补足培养液，摇匀，放置于37℃ CO2培养箱中进行培养。

　　（8）根据细胞生长状态确定换液或传代时间，甚至进行细胞冻存。

　　2 悬浮细胞

　　传代培养操作步骤如下：

　　一般实验室中悬浮细胞传代方法分为直接传代法和离心传代法（培养液中含有细胞碎片的情况下）。当在显微镜下观察到悬浮细胞已经长满至80%~90%（细胞悬液变黄）时，即可进行传代。

　　1 直接传代法：

　　（1）显微镜下观察到细胞状态良好，基本无细胞碎片。

　　（2）立起细胞瓶使细胞自然沉降，用吸头吸取1/2~2/3细胞上清液，弃掉。

　　（3）加入新鲜培养液重悬细胞，以适宜的密度接种于新的培养瓶中，补足培养液，摇匀，放置于培养箱中进行培养。

　　2 离心传代法：

　　（1）用吸头吸取全部细胞悬液至离心管内，1000rpm/min离心3~5min。

　　（2）弃上清，加入适量培养液重悬细胞，轻轻吹打混匀，使细胞均匀分散。

　　（3）用吸头吸取适量细胞悬液，以适宜的密度接种于新的培养瓶中，补足培养液，摇匀，放置于培养箱中进行培养。