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细胞铺板的3种手法(细胞铺板的技巧)

发布时间:2022-07-11 10:35:42 阅读:136562次 来源:百度学术

  细胞铺板是细胞实验中最常见又必须掌握的一门技术,看起来是非常简单的一项操作,但其实却经常会遇到:细胞分布不均匀的情况。要知道把用于实验的细胞铺的均匀且密度适宜,不仅看起来赏心悦目,更是决定了我们实验的稳定性。但是后来才发现,其实细胞铺板是有规律可循的,今天我们就来了解一下:细胞铺板的技巧。我们先来看两组细胞分布不均的图片。

图例

图一:中间多

图例

图二:周围多

  为什么要细胞铺板

  需要根据实验目的选择不同规格的培养板。如在进行药物对待测细胞半抑制率(IC50)测试时,通常使用96孔板,一方面可以设置浓度梯度;另外还可一次性测多个药物,减少实验误差。下面我列举一些常见的几种培养皿规格,大家可根据自己需求自行选择:

图例

  作为一个资深吃货,我用一个通俗易懂的例子,来跟大家解释不知道大家有没有发现,其实细胞铺板和摊煎饼有一点点相似呢?

  煎饼的制作:准备好锅、食材等,把平底锅锅洗干净,平底锅内擦一层油,盛一勺面糊倒入锅内,旋转锅面使面糊均匀流动糊满锅面,然后点火用最最小火煎半分钟,关火收工。

  铺细胞也是一样一样的:

  首先需要一个液化气罐(酒精灯),一个平底锅,根据实验需求(有6孔板、12孔、24孔、96孔),你还需要有一瓶豆油(培养基),刷锅水(PBS),勺子(移液器),各种调料(mimics、inhibitor、G418、5-FU、lipo2000等),面糊(细胞悬液)。

  好了,下面可以开始做煎饼了(铺细胞):

  1、点火;

  2、准备好工具和调料;

  3、刷锅水(PBS)洗两遍;

  4、放点油(培养基),摇匀;

  5、倒入拌匀的面糊(细胞悬液)﹔

  6、摇匀,这一步骤很关键,摇不匀,煎饼就不好看了,前后摇晃10次,左右10 次,逆时针一次,顺时针一次;

  7、放点调料,好了。关火,放到保温箱里,等你饿了(转染),随时就可以享用了。

  细胞铺板收的三种手法:

  1、细胞板子先加入一定量(一般是总量培养基的1/5)的培养基,放入孵箱中放置10-20min;

  2、在滴入细胞时,细胞板子与通风橱有一定的角度,沿着板壁的孔边缘滴入;

  3、滴入后,呈“8”字方法摇晃5-8次;

  4、置于水平台上,放置10-20分钟;

  5、放入孵箱

  其实细胞铺板不一定都需要单个单个的那么均匀,比如做免疫荧光时,因为这个样子可以同时检测到单个细胞的形态,另外又可以照一点低倍的用作于统计,所有的细胞都在一个环境中。特别说明一下:这里的多也只是相对于多,细胞也是单层的。

  铺细胞时要注意手法如下:

  1、细胞板子不需要提前用培养基润洗,直接从边上滴入混有细胞的培养基;

  2、放置30s-1min后,前后摇晃5-8次;

  3、放在水平台上静置2-5min;

  4、放入孵箱。

  一般在提取蛋白或者提取RNA的时候有时会这样铺板,因为有些细胞刮刀不好用,没有办法刮到周围的,想要铺中间多,周围少的板子,手法如下:

  1、细胞板子不需要提前润洗,从中间滴入进去后;

  2、把板子朝一个方向顺时针或者逆时针旋转3-5圈;

  3、水平台上静置2-5min;

  4、放入孵箱。

  细胞铺板收的常见问题解答

  1、细胞计数前后出现较大误差?

  考虑细胞沉降导致悬液不匀;悬液体积过大或过小;稀释倍数太高或太低等原因造成。

  2、如何克服细胞悬液不均匀的问题?

  尽量将细胞吹打为单个,防止抱团,且用移液枪充分吹打,使其均匀悬浮在培养基中。

  3、一般加多少细胞悬液合适?

  由于加入计数室的量,过少会导致计数室内出现气泡,过多则会使得计数板上的盖玻片不紧贴计数板,使得高度变高,体积变大;计数室体积为9mm3,所以一般加15ul左右。

  4、计数时,细胞稀释倍数如何控制?

  若是计数室细胞过稀或过密,会造成较大误差,一般最适浓度为5~10×105细胞/ml。如一般10cm皿的细胞约300-500万个,一些细胞个体小也能达到1000-2000万,可根据所需细胞数目取出部分作稀释或连续稀释后计数。举例来说可将100ul细胞悬液加入到900ul培养基中,混匀后进行计数,计数所得乘以10即为实际细胞密度。

  5、计数的原则有哪些?

  计数时对压在最外圈边线的细胞遵循“计上不计下,计左不计右”的统计学原则,遇到两个以上的细胞组成的细胞团计为一个细胞

  6、对于某些容易聚团的细胞,该怎么办?

  对于容易聚团的细胞,尽管当时摇匀了,但是静置30min后,取出后将细胞培养板后,肉眼即可见严重的细胞居中抱团现象,比如乳腺癌细胞MDA-MB-231。对于这种细胞解决办法:从个人经验来看,若是时间允许的话,可以降低接种密度,可以隔一天细胞多了再进行药物处理或者划线等。

  7、 如何避免每个孔之间的细胞不均匀?

  铺板速度尽量快点,在加完半边板后,需要再次将培养皿内剩余的细胞悬液充分混匀再继续铺板。

  细胞铺板是一个经验积累的过程,手法也需要积极的改进,不要生搬硬套,也不要一味追求绝对的铺均匀。我们在实验过程中多思考细胞本身的特征和属性,在做实验的过程中,不断尝试、不断失败、不断积累,从中得出自己的结论,希望大家可以把在实验过程中出现的问题都能积极解决。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1357.html

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