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细胞实验中提取细胞质和细胞核蛋白的操作步骤

2023-03-18 10:35:49
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  在细胞实验中提取细胞质和细胞核蛋白的操作步骤:

  1.决定细胞生长状态,细胞生长状态应该是80%或者更好:

  2.用离心机以1500r/min离心5min

  3.弃上清液,用等体积的冷PBS洗细胞,像步骤2那样,反复3次

  4.根据估计的沉淀量加入5倍体积的isotonic lysis buffer到细胞颗粒中,使细胞温和悬浮,尽量避免泡沫

  5.加入裂解液lysis buffer在悬浮的细胞中,并放在冰上15min让细胞膨胀,可以通过显微镜检查

  6.对于细胞实验中膨胀的细胞,加入10%的IGEPAL CA-630使后的浓度达到0.3%,混匀,加的时候要温和

  7. 立即离心(量大的可以用1.5mlde EP管,以5500r/min离心30s;量大的可以用50ml的管子以5500r/min离心2min)

  8.转移上清液(细胞质蛋白)到一个新的冷冻管中

  9.用悬浮颗粒5倍体积的isotonic lysis buffer悬浮细胞,并混匀

  10.用离心机离心细胞悬浮液,以1500r/min离心5min,移掉上清液

  11.用2/3倍体积的extraction buffer悬浮颗粒

  12.把管子放置在震荡混匀器上,以700r/min,15min震荡混匀,接着以1400r/min,15min,整个过程要仔细,避免泡沫产生

  13.以9400r/min离心15min,离心完后转移上清液到一个新的冷冻离心管中

  14.分成几份用液氮冷冻,并且保存起来(长期保存应放在-80℃上,短期保存要放在-20℃上)

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