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免疫荧光实验总结盘点

2023-03-03 10:29:38
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  免疫荧光实验是一种常用的细胞和分子生物学实验技术,用于检测蛋白质的表达和定位。

  1、了解及预测蛋白的定位

  例如:下图使用肺动脉内皮细胞( BPAE)观察线粒体的显色,采用 405nm,488nm,561nm 的激光,100x NA 1.49 的物镜对细胞内线粒体的分布进行简单的观察,此图可见,单纯的 mito-tracker 并不能清晰看见线粒体内部的结构和蛋白相关关系,因此,明确蛋白定位,根据所需分辨率选择显微镜、相应的荧光蛋白和探针非常重要。比如研究者应大致预测观察目标是存在于线粒体外膜表面,或者线粒体嵴上,或者仅需观察经处理后线粒体的形态及分布以选择不同的荧光蛋白/荧光有机小分子探针/纳米荧光探针等 (一般来说荧光蛋白比小分子荧光探针体积更大,在超微显像过程中较大小分子荧光探针等更有利于显微结构的染色)。

图例

  2、减少背景噪声

  一张清晰的研究图片应当避免过多的干扰光点出现。在免疫荧光实验中,应尽量保证每次 PBS 清洗次数和时间,减少杂质。细胞免疫荧光相比较于组织免疫荧光略有区别,一抗应在孔板内完成孵育步骤,载玻片上孵一抗时免疫组化笔干燥结块脱落会引起再爬片杂光。

  此外尽量保证盖玻片的洁净非常重要。经伽马射线处理的盖玻片应为免疫荧光的首选材料(但价格昂贵),普通的生物研究者可以 google 一下简单但硅烷化处理 protocol,提前处理好盖玻片(使盖玻片表面疏水且带有正电荷),对于有高分辨率要求的荧光实验,此步骤非常关键。

  3、荧光图片的保存

  常用的荧光图片保存方法抗荧光淬灭剂必不可少,笔者觉得 DAKO 和 invitrogen 的抗荧光淬灭剂非常好用,比较起来,invitrogen 的性价比更高。国产的抗荧光淬灭剂目前还没有试到特别好用的品牌。除了抗淬灭剂外,手动在抗淬灭剂里添加一点叠氮化钠,抗淬灭效果更优。细胞荧光实验淬灭剂不可以过多,否则影响后期拍摄。

  经过良好保存的免疫荧光片子,在常温下放 3 - 6 个月一般来说还可以拿出来拍片(个人经验),遇到过特别优秀的师兄荧光片放了 3 年重新照相还是清晰明了。

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