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实时定量PCR实验常见问题(附带解决方法)

2023-02-13 10:45:57
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  实时定量PCR技术(real-time PCR)也叫qPCR(Quantitave PCR),是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。它是一项临床上非常成熟的技术,目前在分子生物学领域,qPCR核酸定量的首选方法。目前仍在全球肆虐的新型冠状病毒鉴定的“金标准”——核酸检测就是通过qPCR原理进行的。

  那么拿到一个样本,需要经过以下多项操作流程才能定量检测到它的核酸含量。其中任何一个步骤操作失误都会导致它的检测结果出现异常!

  1、无Ct值出现

  a) 检测荧光信号的步骤有误:一般染料法采用72℃延伸时采集,探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

  b) 引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。

  c) 模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

  d) 模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

  e) 反应循环数不够:一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环,但高于45个循环会增加过多的背景信号。

  2、Ct值出现过晚

  a) 扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物。

  b) 模板浓度太低:减少稀释度,重复实验。

  c) 模板降解:重新制备模板,重复实验。

  d) PCR产物太长:一般将PCR产物长度设计为100 bp-200 bp之间。

  e) 反应体系中存在PCR反应抑制剂:一般为加入模板时带入,导致模板质量不高,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。

  3、阴性对照出现明显扩增

  a) 反应体系组分(如水)被污染:实验过程中,更换新的Mix或者水重复实验。

  b) 标本间的交叉污染或产物污染:反应体系在超净工作台内配制,对实验室进行严格的区分,减少气溶胶污染;使用带滤芯的枪头。

  c) 引物二聚体的出现:引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

  d) 引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。在35循环后阴性对照出现扩增属正常情况,可配合熔解曲线进行分析。

  4、熔解曲线出现多峰

  a) 非特异性扩增。

  b) 引物设计不佳:避免二聚体和发夹结构的出现。

  c) 引物浓度不佳:适当调整引物浓度。

  d) 退火温度低:提高退火温度。

  e) 模板中有基因组DNA的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的污染(DNaseI处理),或通过设计引物避免非特异性扩增。

  5、出现引物二聚体

  a) 优化扩增条件,如提高退火温度,可利用梯度PCR,摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由95℃变性步骤直接进入60℃退火和延伸步骤)有利于强效扩增,因此引物设计时设定的成功退火温度为60°C。

  b) 引物浓度太高,适当降低引物浓度。

  c) 可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带,通常位于100 bp以下。

  6、扩增效率低

  a) 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

  b) 反应条件不佳:适当降低退火温度或改为三步扩增法。

  c) 反应体系中有抑制物:一般为模板中引入,应先把模板适当稀释,再加入到体系中,减少抑制物的影响。

  7、实验重复性差

  a) 加样体积失准:使用性能较好的移液枪,扩大反应体积,将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中。

  b) 定量PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。

  c) 模板浓度太低:模板浓度越稀,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。

  d) qPCR mix没有完全混匀,请使用前充分混匀。

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