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构建稳定细胞株方法及注意点

2023-01-10 10:36:31
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  实验中很多情况下我们都要用到稳定细胞系,但质粒建系时间长,成功率低,很多时候耗时半年还不见成效,眼看别人实验都收尾了,自己这边却还没有动静,耗在上面的时间精力足够写一篇血泪史!

  但是现在不用担心!

  今天我们就来聊一聊,要稳定建系并且更好!

  稳定转染,即进入细胞的质粒整合入细胞基因组中,并能随细胞分裂稳定传递下去。这是相对瞬时转染而言的。

  瞬时转染的表达,外源基因导入整合基因组的几率非常低,绝大部分以游离形式存在,导致最后拷贝数被稀释,无法达到持续表达外源基因的目的。一般用转染试剂进行质粒转染,多为瞬时转染。

  那么在什么情况下我们需要构建稳定株呢?

  1、一般如下情况需要构建稳定株

  长期在目的细胞中研究,通过构建稳定株,可以大大或者病毒,也极大方便实验研究;

  部分蛋白半衰期极长,瞬时RNA只能干扰表达,无法去除已经表达的目的蛋白,通过构建稳定株可以实现更好的

  瞬转往往会引入极高拷贝数的表达,导致因为人为因素造成实验结果的不精确,构建稳定株可以帮助进行实验研究;

  需要用诱导表达系统的,主要是一些致死基因或者是需要时空表达的;

  需要用细胞的,比如裸鼠成瘤等,往往需要构建成稳转株

  2、构建稳定株的方法

  其实用脂质体转染、磷酸钙转染法等理论上是可以构建稳定株的,但这些方法整合入基因组的效率极低,很难成功。而可以携带外源基因随机整合进基因组,效率很高,是建立稳定株的最优方式。

  3、构建稳定株的注意点

  稳定株构建是个长期过程,从质粒构建到慢病毒包装,再到细胞感染及后期的筛选,每一步都至关重要,所以建立稳转株花个半年时间,也是常有的事,而且要承担病毒包装不成功,细胞感染效率低等风险。

  所以,想要短期内高效构建出稳定细胞株,就不要错过汉恒提供的“三严”稳转株构建服务:

  l 种子优良-- 严 选低代数细胞来源,无支原体无黑胶虫;

  汉恒生物所有的细胞均从中科院细胞库购买,代数低无污染,可提供STR检测报告

  l 性状稳定-- 严 酷的筛选及靶基因表达验证体系;

  汉恒生物所有的稳转株都采用RT-qPCR验证,保证表达水平

  l 活力无损-- 严 格的建系后连续3代细胞增殖活力评价

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