流式细胞术（Flow cytometry，简称FCM）是一种基于流式细胞仪通过检测偶联荧光信号快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞或者颗粒）的多项特性技术，同时可以对特定群体进行分选。早期流式细胞术主要用于定性，后续慢慢发展为多参数定性、定量以及分选的技术。

　　研究对象：

　　颗粒性物质，如大量的临床样本、外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液以及各种培养细胞、藻类、原生动物、病毒等生物性颗粒及人工合成微球等物理颗粒。

　　研究目的：

　　通过流式分析研究颗粒性物质的特性，包括多种物理及生物学特征；通过利用不同荧光素标记不同组分将目的细胞与非目的细胞区分开来，从而获得纯度更高的目的细胞群并研究其物理及生物学特性。

　　技术特点：

　　1.检测速度快；

　　2.准确性好；

　　3.精确度高；

　　4.细胞不被破坏；

　　5.灵敏度高；

　　6.可进行多参数检测；

　　7.不单限于表面抗原，可根据发光度（如细胞体积）或荧光散射度（如DNA、RNA或蛋白含量、酶活性、特异抗原）来分离细胞。

　　流式细胞术的发展

　　流式细胞术是20世纪60年代后期开始发展起来的，流式细胞仪通过接受激光照射液流入细胞后的散射光信号和荧光信号反应细胞的物理化学特征，如细胞大小、颗粒度和抗原分子的表达情况等。主要应用于生命科学的基础研究，尤其是免疫学、细胞生物学和分子生物学。80年代后期开始应用于临床，辅助多种疾病的诊断，尤其是白血病的诊断和分型。随后，利用流式分选干细胞过继回输用于疾病治疗，如NK细胞回输提高免疫力，CIK治疗等。

　　随着流式细胞术的发展，出现了多种型号的流式分析仪、分选仪，同时随着配备的激光器的不断升级，有些流式分析仪可进行多达10色以上的荧光分析。流式分析软件的不断优化，使得流式结果分析变得更加快速、便捷，并能简单获得多形式的流式分析示图，极大地丰富了生物学检测分析应用领域。这一集多个学科的智慧于一身，将计算机、电子工程、光学、流体力学、数学及有机化学等多学科巧妙地融合起来而诞生的流式细胞术在免疫学、发育生物学、细胞动力学、生理学、细胞生物学、分子生物学等生物学及医学研究的各个领域得到了广泛的应用，具有重大应用价值。

　　流式细胞术的3大要素：

　　01流式细胞仪

　　尽管市面上有不同品牌的流式细胞仪，例如BD,Beckman coulter,Partec,Miltenyi,Agilent,Thermo等等，但其主要构成不外乎液流系统、光路系统、监测分析系统。

　　（1）液流系统

　　（2）光路系统

　　光路系统即我们常说的激光器，根据其发射激光波长来分，如常见488nm蓝激光器、635nm的红激光器和405nm的紫激光器，由激光器发出的激光照射到细胞后其产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收。这些光信号包括散射光和荧光信号，FSC（散射光信号，用于量化反应细胞的大小）、SSC（侧向散射光，用于量化反应细胞的复杂程度），这些荧光信号来源于细胞上偶联的荧光素，被激光激发后，会发射荧光信号。

　　（3）检测分析系统

　　流式细胞仪的检测分析系统就是以通道为单位将细胞的各个通道的光信号汇总分析，最终归类样本群体中的细胞物理化学特征。

　　通道，即光电倍增管，其主要作用为：将光信号转变为电子信号；放大电子信号；分为散射光通道（FSC通道、SSC通道）以及荧光通道。一个激光器可以有多个荧光通道，一个通道可以对应多个荧光染料。

　　02样品细胞

　　流式细胞术检测对象包括细胞和组织，但是无论细胞或者组织，最终制备上样的样品均需要为单细胞悬液。这是由于细胞或者组织团块以及碎片容易堵塞进样管。

　　03 荧光偶联抗体

　　由于样本细胞表达强弱是根据标记在其表面的荧光素被激光照射后激发出的荧光信号强弱来判断的，所以样本细胞必须标记偶联荧光素抗体。

　　常见的流式细胞术应用

　　1 .细胞群比例测定以及表型测定

　　运用流式细胞术测定某细胞群体或者细胞亚群的比例是其最基本功能。要完成细胞群比例测定我们需要明确：要测定的总体是什么，例如免疫细胞的特征表型是CD45,T细胞的特征表型是CD3，由此我们可以得到一群CD45+CD3+ 或者CD45+CD3-细胞，同理我们也可以对得到的这群细胞进行进一步划分，最终得到我们的目标细胞群比例测定或者是表型测定。

　　2 .细胞表面分子、胞内抗原的检测与分析

　　选择与荧光素偶联的抗体或使用一抗和与荧光素偶联的二抗，通过抗原抗体结合原理，实现检测细胞表面分子、胞内抗原表达量的目的，并可以作为一种抗体开发质控检测手段。

　　3 .细胞DNA倍体与周期检测与分析

　　细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段，是细胞从2倍体到4倍体再分裂成2倍体的过程。

　　碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料。可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0，S和G2/M三期，从而可通过流式直方图对各时相细胞百分率进行分析。

　　4 .细胞凋亡的检测与分析Annexinv/PI双染法

　　细胞凋亡（Apoptosis）是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。通过流式细胞术分析，可快速准确的得到细胞处于早期、晚期凋亡的细胞比例，反映药物处理对细胞状态的影响。

　　在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来

　　Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，实验结果越不可信，建议实验中尽量控制这一象限细胞比例。

　　Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。

　　Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。

　　Q4：(AnnexinV-染料)-/PI--，此区域的细胞为活细胞。

　　5

　　流式分选术应用的运用解决了细胞学研究中一个很重要的课题分离纯化，尤其是需要研究细胞功能时，如收集细胞培养上清通过ELISA检测细胞分泌的细胞因子，细胞共培养检测细胞的功能等，都需要得到高纯度的细胞。

　　多重荧光标记的流式细胞分选技术检测小鼠肌卫星细胞数量流式细胞术展望

　　流式细胞术以其速度快、精度高、准确性好等优点，在学术研究、临床治疗等方面具有广泛应用前景，并获得越来越多的学术研究者及医药工作者的青睐。流式细胞仪也随科技的进步向小型化、微型化、多重荧光分析方向发展，分析灵敏度和准确性也明显提高。随着生物医药的发展，流式细胞术的应用几乎涵盖了整个生命科学和医学领域，将来也必然在学术研究、临床免疫学、临床血液肿瘤学、临床微生物学应用、细胞分选等方面得到更广泛的应用。

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　　流式单抗案例展示

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　　陈朱波，曹雪涛，2021版《流式细胞术》