三点引物设计一般原则

2022-11-30 10:26:20

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　　一个完整的PCR扩增体系主要由引物、酶、dNTP、模板和Mg2+等基本要素所组成。

　　引物设计的原则引物不但决定了PCR扩增片段的长短，也是PCR扩增特异性的关键，要保证PCR扩增的特异性，引物一定要与模板DNA具有完全的互补性。

　　理论上，任何模板DNA，只要其核苷酸序列是已知的，就能按其序列设计合成一定长度的互补寡核苷酸链做引物，从而将特定长短的靶DNA在体外大量扩增。

　　一、引物设计的一般原则

　　引物长度以18~30bp为宜，以20bp左右最为常用。

　　引物过短，易导致非特异扩增。

　　较长的引物虽特异性好，但在引物内易形成二级结构，如发夹环， 1. 引物扩增跨度(扩增片段长短): 扩增片段在普通PCR以200~500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段实时荧光PCR则为70~ 150bp

　　2.引物 G +C比例及碱基:

　　G+C含量以140%~60%为官，G+C比例太低扩增效果不佳，G+C比例过高易出现非特异条带。

　　此外，ATGC最好随机分布.避免出现重复的基序。

　　重复的基序通常包括简单重复如4个以上核苷酸的重复序列(--CCAGCT---CCAGCT--)、倒装重复如4个或4个以上核苷酸自我互补序列基序(--TTACCG---CGGTAA--)和均一的多聚核苷酸的成串排列如4个或4个以上的相同的核苷酸---TTTTT---)。

　　3.引物的熔解温度(Tm):

　　引物的Tm与其长度、序列组成(G+C比例)和浓度有关，通常理想引物的Tm应在55~60°℃引物的Tm对PCR扩增的特异性影响较大。引物对之间的Tm的差异应不超过2~3℃，如差异过大，扩增效率将大大降低，甚至不出现扩增，因为如果引物Tm较高，当在低于理想的退火温度时，将出现错误的扩增引导。

　　如果Tm较低，则引物只在于高于理想的退火温度时以低浓度结合。引物的Tm可按下式计算：即Tm=2°C(A+T)+4°C(G+C),退火温度的选择通常是低于Tm约5℃。

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