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三点引物设计一般原则

2022-11-30 10:26:20
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  一个完整的PCR扩增体系主要由引物、酶、dNTP、模板和Mg2+等基本要素所组成。

  引物设计的原则 引物不但决定了PCR扩增片段的长短,也是PCR扩增特异性的关键,要保证PCR扩增的特异性,引物一定要与模板DNA具有完全的互补性。

  理论上,任何模板DNA,只要其核苷酸序列是已知的,就能按其序列设计合成一定长度的互补寡核苷酸链做引物,从而将特定长短的靶DNA在体外大量扩增。

  一、引物设计的一般原则

  引物长度以18~30bp为宜,以20bp左右最为常用。

  引物过短,易导致非特异扩增。

  较长的引物虽特异性好,但在引物内易形成二级结构,如发夹环, 1. 引物扩增跨度(扩增片段长短): 扩增片段在普通PCR以200~500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段 实时荧光PCR则为70~ 150bp

  2.引物 G +C比例及碱基:

  G+C含量以140%~60%为官,G+C比例太低扩增效果不佳,G+C比例过高易出现非特异条带。

  此外,ATGC最好随机分布.避免出现重复的基序。

  重复的基序通常包括简单重复如4个以上核苷酸的重复序列(--CCAGCT---CCAGCT--)、倒装重复如4个或4个以上核苷酸自我互补序列基序(--TTACCG---CGGTAA--)和均一的多聚核苷酸的成串排列如4个或4个以上的相同的核苷酸---TTTTT---)。

  3.引物的熔解温度(Tm):

  引物的Tm与其长度、序列组成(G+C比例)和浓度有关,通常理想引物的Tm应在55~60°℃引物的Tm对PCR扩增的特异性影响较大。 引物对之间的Tm的差异应不超过2~3℃,如差异过大,扩增效率将大大降低,甚至不出现扩增,因为如果引物Tm较高,当在低于理想的退火温度时,将出现错误的扩增引导。

  如果Tm较低,则引物只在于高于理想的退火温度时以低浓度结合。引物的Tm可按下式计算:即Tm=2°C(A+T)+4°C(G+C),退火温度的选择通常是低于Tm约5℃。

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