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核酸降解的预防方法

发布时间:2022-11-21 10:25:32 阅读:1322次 来源:百度学术

  核酸降解本质

  核酸降解是DNA/RNA分子中的碱基和戊糖间的氮糖苷键,或磷酸二酯键在物理因素、化学因素和生物因素等作用下发生水解,使DNA/RNA链发生断裂。

  核苷磷酸化酶:能分解核苷生成含氨碱基和戊糖的磷酸酯酶。广泛存在于生物体内,催化的反应可逆。可在核苷水解酶作用下继续分解核苷成嘌呤碱、嘧啶碱和戊糖。

  核苷水解酶:主要存在于植物和微生物体内,只水解核糖核苷。

  核酸降解原因

  DNA降解的因素很多,主要分为物理因素,化学因素和生物因素。

  一、物理因素:温度,机械剪切力、核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等。

  二、化学因素:PH值,水解反应,氧化反应等。

  三、生物因素:酶解及微生物侵染等作用。

  01物理因素的影响

  ★ 温度:高温条件下,RNA不稳定,易加速磷酸二酯键的水解,使核酸降解;

  ★ 机械剪切力:包括剧烈震荡、搅拌、细胞突然至于低渗溶液中,以及让溶液快速通过狭长的孔道;

  ★ 核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等,均会导致核酸的降解。

  02化学因素影响水解

  ★ PH值:氢离子参与催化磷酸二酯键、糖苷键的水解,但糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解。过高或过低的PH值都易破坏复键。核酸(特别是RNA)在碱性溶液中十分容易降解;

  ★ 氧化反应:会氧化碱基中的含氨杂环,使其变性,从而改变一级与二级的核酸构象;

  ★ 苯酚在空气中被氧化生成醌,它能够产生自由基,直接用于DNA的分离,会使磷酸酯键断裂,造成DNA的降解。

  03生物因素影响

  ★ 酶解:核酸酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键,直接破坏核酸的一级结构,使其降解。

  1.核酸酶(磷酸二酯酶)

  核酸内切酶:在环境或生物体内具有识别双链DNA分子中特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链的核酸内切酶统称为限制性核酸内切酶。作用方式从多聚核苷酸链中间开始,在某一个位点切断磷酸二酯键。如DNase,RNase等。

  核酸外切酶:核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端(3'-端或5'-端)开始,逐个水解切除核苷酸。如蛇毒磷酸二酯酶,牛脾磷酸二酯酶等。

  2.核苷酸酶(磷酸单酯酶)

  专一性的磷酸单酯酶:3'-核苷酸酶,5'-核苷酸酶

  非专一性磷酸单酯酶。

  ★ 微生物侵染:微生物会将DNA作为营养物质或是其分泌的化学物质含酶。

  预防降解的方法

  预防RNA降解的方法:

  ★ 去除环境中RNase酶的污染或强有力地抑制其活性。

  ★ 获取样品后最好立即提取RNA,若无条件立即实验,应于-80℃液氮中保存样品,提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞,以防RNA降解。

  ★ 在总RNA提取分离的最初阶段,联合使用Rnase的特异抑制剂,尽可能的灭活胞内的Rnase的活性。

  ★ 避免样品的反复冻融。

  ★ 保证裂解液的质量,裂解液的用量不足,也会导致RNA降解。

  ★ RNA提取后,放入-80℃保存,防止降解。

  预防DNA降解的方法:

  ★ 简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏;

  ★ 减少化学物质对DNA的降解,为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏;

  ★ 防止基因组DNA的生物降解,主要是DNase降解基因组DNA,Dnase需要二价金属阳离子Mg2+等的激活,可用EDTA等金属离子整合剂整合Mg2+以抑制Dnase的活性;

  ★ 减少物理因素对DNA的降解,物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈震荡、搅拌等);

  ★ 避免样品的反复冻融,可将DNA分装保存于缓存液中;

  ★ 所有试剂应用无菌水配制,耗材经高温灭菌;

  ★ 避免DNA的过高温处理等。


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