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WB的免疫印迹实验操作步骤

2022-11-15 10:29:38
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  WB,蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting),是采用印迹技术将蛋白质转移到膜上,再根据抗原-抗体的特异性结合,检测复杂样品中的某种蛋白的方法,该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

  实验原理

  WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)将混合蛋白质样品分离后,利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质(例如PVDF膜)上,再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与相对应的第一抗体特异性结合,之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合,最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

  ①膜处理(甲醇 1min,风干(放滤纸上),甲醇 1min,水 1min)

  ② 封闭(用 TBST 配 5%牛奶)1h 配摇床

  ③ 加一抗,牛奶稀释,所需浓度参考抗体说明书,看膜的大小配多少一抗,4°过夜。

  ④ 室温孵育 20min

  ⑤ 0.1%TBST 洗 10min x 3 次配摇床(0.1%TBST:tris12.1g,NaCl87.66g,HCl 至 PH7.6 后定容至 1L 后,加入 1ml 的 TWEEN20)

  ⑥ 加二抗,牛奶稀释,一般 1:10000,1h 配摇床

  ⑦ 0.1%TBST 洗 10min x 3 次配摇床

  ⑧ 发光(A 液 B 液等体积混合,孵膜 1min,正面朝上放入仪器内发光)

  经验总结:

  封闭液的选取具体得看抗体说明书,有的抗体是明确要求只能用 BSA,而且封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求,但是一般情况 5%BSA 的效果会比 5%牛奶要好。 信号通路一般都是用 5%BSA 封闭。 信号通路在洗膜的时候用快速摇床 5min/次 3 次就可以了。 如果你想省时间,一抗可以放在 37℃1~2hour,但是一定要封好,以免温度太高而导致抗体 干了出现假阳性。二抗可以 37℃半个小时。 发光液的选取,如果是一般的抗体,建议用一般的发光液效果会好一点,如 keygen 的,背景会比较干净。但是一些难发出来的一般建议用灵敏度更高的发光液如 FD 的或者是 MILLIPORE 之类的发光液。


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