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LncRNAs的鉴定方法(lncrna是怎么产生的)

2022-03-22 10:33:16
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  1. lncRNA阵列技术

  在lncRNAs研究的初期,新lncRNAs的发现主要是通过使用cDNA克隆和Sanger测序(FANTOM项目)或识别染色质特征(如K4-K36三甲基化标记的存在),以及以组织和细胞特异性的方式在基因组非编码区使用平铺微阵列来进行的。日本理研所的FANTOM项目通过生成和测序含有近60,770个全长cDNA的cDNA文库,首次提供了大约16,000个小鼠新转录本(70%为假定的ncRNAs)的转录本目录。

  SAGE是最早开发的转录组组装和分析的方法之一,它是基于cDNA序列3’末端产生包含限制性内切酶位点的短片段标签,然后进行Sanger测序。该方法允许识别一些未注释的转录本,还揭示了lncRNAs广泛分布于人类所有染色体并显示出高度的组织特异性。

图例

图1.基于NGS技术的lncRNAs鉴定

  (Jathar S , et al. Advances in experimental medicine & biology, 2017.)

  2. RNA-seq

  RNA-Seq是一种定量且高灵敏度的技术,基于将转录物转化为cDNA库,从而构成测序文库 。该文库是通过RNA片段化、接头连接、cDNA 合成、转录本长度选择和有限的扩增循环来制备的。文库可以通过选择性去除 rRNA,从富含 poly (A)+的RNA 中制备。然而,这种方法排除了非多聚腺苷酸化或部分降解的RNA,这也可能导致从检测样本中排除可能的新转录本。这个缺点可以通过使用随机启动方法或通过从样品中选择性排除rRNA 来解决。

  此外,基于实验需要,ChIP/RNA-Seq(用于转录和表观遗传调控)、ChIA/RNA-Seq(用于染色质相互作用分析)和DNA/RNA-Seq(用于基因组组装)等技术已经进化并被广泛使用。

  3. 单细胞RNA-Seq

  大多数转录组学研究是在体细胞样本的群体水平上进行的,其中基因表达数据是每种细胞类型中基因表达水平和群体中每个细胞相对丰度的结果。由于大多数lncRNAs表现出基于特定细胞类型/阶段的特定表达模式,目前的测序技术虽然强大,但可能无法捕捉细胞之间微妙及潜在的生物学意义的差异。在这种情况下,单细胞转录组分析为识别和研究lncRNAs提供了新的维度和更高的分辨率。但该方法还有一定的局限性,因为它只针对于poly (A)+的RNA,且灵敏度仍需进一步提高。


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