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原生质体叶肉细胞瞬时表达

2022-11-11 10:18:00
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  1、生长培养好的试验材料(一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片)

  2、在拟南芥开花前取样(30片叶子左右即可)

  3、切取叶片为0.5-1mm的细条(如果材料能达到每克107个原生质体,10-20片叶子需要5-10mL酶解液)

  4、迅速将切下的样品转到酶解液中,要求完全浸没。

  5、黑暗条件下抽真空30min。

  6、连续酶解,室温下23℃黑暗中静止酶解3h

  7、利用光学显微镜检查原生质体(30-50μm大小)

  8、在过滤前加入等量的W5溶液

  9、洗干净滤网,并用W5润湿,之后过滤

  10、离心100g,1-2min沉淀原生质体,尽可能吸走上清,重复洗2次

  11、重悬原生质体于W5中,保持在2*105个/ml,冰浴30min。

  12、100g离心2min,尽可能吸走上清,利用MMG重悬,浓度约2*105个/ml

  13、加入10μL质粒(1000ng-2000ng)于2ml离心管中

  14、加入100μL原生质体(2*104个),轻轻混匀。

  15、加110μL PEG solution,轻弹使充分混匀

  16、23℃室温孵育30min。

  17、加400-440μL W5混匀,终止反应

  18、100g,2min 23℃离心,去上清,重复洗一次

  19、用1mL W5重悬原生质体并放入6孔板中培养

  20、20-25℃孵育16h以上

  21、取样制片观察

  溶液配制:

  1、酶解液的配制(20ml)

图例

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