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qPCR实验中影响Cq值的相关因素

2022-11-11 10:26:44
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  qPCR实验中许多因素会影响您的 C q 值。 您的样品之间C q 值的一些差异将是由于生物事件,例如您的目标基因响应治疗而上调/下调。然而,C q 值同样容易受到 PCR 反应准备和 PCR 组分本身的影响。比较常见的是以下几种情况:

  1. 主混音

  溶液中的 pH 值和盐浓度会影响荧光发射。荧光发射的任何变化都会自然地改变您的 C q值。因此,请确保您只使用高质量的 PCR 组件,如果使用自制溶液,请在每次实验前检查 pH 值并监测盐沉淀。

  2. 被动参考染料

  反应值是您的 FAM(报告基因)染料与您的 ROX(被动参考)染料的荧光比率。假设 FAM 荧光不变,较低量的 ROX 会产生较高的反应值。

  3. 反应效率

  PCR 反应效率取决于预混液性能、引物的特异性、引物退火温度和样品质量。一般来说,90% 以上的 PCR 效率是可以接受的。100% 的 PCR 效率表明感兴趣的目标序列在每个循环中加倍。完美的 PCR 效率与模板 10 倍稀释之间 3.3 个循环的变化相吻合。

  要确定每个引物对的 PCR 效率,请使用五个 10 倍稀释步骤对模板进行系列稀释,并计算 R 2 ,这是一种描述一个值预测另一个值的统计量度。对于接近 100% 的 PCR 效率,您的 R 2 值应大于 0.99。

  对标准曲线上的每个点至少运行三个重复。对于低拷贝数输入,更高的重复数尤其重要,因为重复数之间的变化更有可能发生。

图例

  4. 其他问题

  假设您已经排除了上述 3 个因素,导致 C q 值晚的常见原因可能是:

  模板太少 - 尝试使用更多模板。

  次优的核酸分离——考虑您的核酸分离方案,量化您的 DNA,运行琼脂糖凝胶,尝试其他方案/ 试剂盒。

  cDNA 合成过程中逆转录酶活性较差——逆转录酶对降解敏感。订购一个新的。

  RNA/cDNA 降解——保持您的工作空间清洁,改善您的RNA 处理行为 ,避免 cDNA 的多次冻融循环。

  PCR抑制。

  另外,其他原因也同样会影响定量PCR 的Cq值,包括细胞系/培养物中的感染或污染,但这些问题通常在核酸分离之前被发现。

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