qPCR实验中许多因素会影响您的 C q 值。 您的样品之间C q 值的一些差异将是由于生物事件，例如您的目标基因响应治疗而上调/下调。然而，C q 值同样容易受到 PCR 反应准备和 PCR 组分本身的影响。比较常见的是以下几种情况：
1. 主混音
溶液中的 pH 值和盐浓度会影响荧光发射。荧光发射的任何变化都会自然地改变您的 C q值。因此，请确保您只使用高质量的 PCR 组件，如果使用自制溶液，请在每次实验前检查 pH 值并监测盐沉淀。
2. 被动参考染料
反应值是您的 FAM（报告基因）染料与您的 ROX（被动参考）染料的荧光比率。假设 FAM 荧光不变，较低量的 ROX 会产生较高的反应值。
3. 反应效率
PCR 反应效率取决于预混液性能、引物的特异性、引物退火温度和样品质量。一般来说，90% 以上的 PCR 效率是可以接受的。100% 的 PCR 效率表明感兴趣的目标序列在每个循环中加倍。完美的 PCR 效率与模板 10 倍稀释之间 3.3 个循环的变化相吻合。
要确定每个引物对的 PCR 效率，请使用五个 10 倍稀释步骤对模板进行系列稀释，并计算 R 2 ，这是一种描述一个值预测另一个值的统计量度。对于接近 100% 的 PCR 效率，您的 R 2 值应大于 0.99。
对标准曲线上的每个点至少运行三个重复。对于低拷贝数输入，更高的重复数尤其重要，因为重复数之间的变化更有可能发生。
4. 其他问题
假设您已经排除了上述 3 个因素，导致 C q 值晚的常见原因可能是：
模板太少 - 尝试使用更多模板。
次优的核酸分离——考虑您的核酸分离方案，量化您的 DNA，运行琼脂糖凝胶，尝试其他方案/ 试剂盒。
cDNA 合成过程中逆转录酶活性较差——逆转录酶对降解敏感。订购一个新的。
RNA/cDNA 降解——保持您的工作空间清洁，改善您的RNA 处理行为 ，避免 cDNA 的多次冻融循环。
PCR抑制。
另外，其他原因也同样会影响定量PCR 的Cq值，包括细胞系/培养物中的感染或污染，但这些问题通常在核酸分离之前被发现。
