肿瘤恶性化表型研究，最常见的为细胞迁移，细胞侵袭，细胞增殖的研究。今天为大家介绍一下其对应的实验原理与方法。

　　一：检测细胞迁移能力，最常见的实验为细胞划痕。

　　（1）实验原理：细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞划痕实验室研究细胞迁移的最常用的体外试验方法。当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。

　　（2）实验步骤：

　　1. 细胞密度约80-90%时，分别进行实验组和对照组的细胞分盘。首先加入预热的胰酶消化细胞，显微镜下观察细胞脱离培养皿形成单个或者团状的细胞，加入培养基终止消化反应。然后轻轻吹打混匀细胞，将细胞均匀种于六孔板。

　　2. 24h后，待细胞均匀铺满，用枪头比着直尺，垂直划一条直线，注意枪头要垂直，不能倾斜。注意保证实验组和对照组宽度相近。由于机械划痕时会对边缘的细胞造成损伤，可以选择购买划痕插件，即避免细胞损伤又能保证细胞宽度相同。

　　3. PBS轻洗细胞3次，加入无血清培养基。

　　4. 放入37度5%CO2培养箱。按0， 12，24小时取样，拍照。拍照时“划痕”的方向最好在视野内为水平的或者垂直的。

　　二：检测细胞侵袭能力，最常用的实验方法为Transwell侵袭实验。

　　（1）实验原理：利用一层膜（基质胶）将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了寻找营养，细胞会往高营养的培养液里面迁移。主要是模拟细胞分泌金属蛋白酶消化细胞外基质，转移至其他组织的过程。由于只有具有侵袭能力的细胞才可进行Transwell侵袭实验。因此实验前最好先用明胶酶谱法检测MMPs的表达。

　　（2）实验步骤：

　　1. 让细胞撤血清饥饿12－24h，去除血清的影响。

　　2. 在无菌条件下将Matrigel胶冰浴融化。然后用无血清培养基稀释配制Matrigel ，比例1：4-1：8，稀释后在Transwell小室上室铺40ul/孔。

　　3. 37℃放置2h，至Matrigel胶凝固,用无血清培养基水化30min。

　　4. 用预热胰酶消化细胞，显微镜下观察细胞脱离培养皿形成单个或者团状的细胞，加入培养基终止消化反应。

　　5. PBS轻洗细胞3次，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×105细胞处理后，取10万细胞铺到上室。

　　6. 48h后待细胞穿到下室，用棉签轻轻擦去基质胶和上室内的细胞。小室于室温彻底风干，以方便后一步染色。

　　7. 0.1%结晶紫染色。

　　8. PBS洗去多余结晶紫。

　　9. Transwell小室与正置显微镜进行观察和拍照，随机选取多个视野进行细胞计数。

　　三：检测细胞增殖能力，最常用的实验为CCK8增殖实验。

　　注：科研小助手在之前详细讲解过MTT和CCK-8实验

　　（1）实验原理：WST-8在电子耦合载体1-Methoxy PMS存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲臜产物，颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。对于许多肿瘤耐药株，可以在实验组与对照组加入药物处理后，可以通过cck8检测使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映细胞活性。

　　（2）实验步骤：

　　1. 细胞消化为细胞悬液后，取 96孔板，每空加入100μL。置于培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。在96孔板的四围可以加入PBS，防止细胞培养过程中液体蒸发过多。

　　2. 12、24、48小时分别向培养板加入待测药物试剂。

　　3. CCK8检测：

　　（1）弃去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100ul培养基，向每孔加入10μLCCK8溶液。其中预留的PBS孔加入CCK8作为空白组。

　　（2）将培养板在37度培养箱内孵育1-4h。

　　（3）酶标仪测定在450nm处的吸光度。

　　细胞活性计算公式如下：

　　细胞活力（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100

　　其中：

　　A（加药）：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度。

　　A（空白）：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度。

　　A（0加药）：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度细胞活力。