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肿瘤恶性化表型研究(细胞迁移,细胞侵袭,细胞增殖的研究)

发布时间:2022-10-12 10:32:18 阅读:11782次 来源:百度学术

  肿瘤恶性化表型研究,最常见的为细胞迁移,细胞侵袭,细胞增殖的研究。今天为大家介绍一下其对应的实验原理与方法。

  一:检测细胞迁移能力,最常见的实验为细胞划痕。

  (1)实验原理:细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞划痕实验室研究细胞迁移的最常用的体外试验方法。当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。

  (2)实验步骤:

  1. 细胞密度约80-90%时,分别进行实验组和对照组的细胞分盘。首先加入预热的胰酶消化细胞,显微镜下观察细胞脱离培养皿形成单个或者团状的细胞,加入培养基终止消化反应。然后轻轻吹打混匀细胞,将细胞均匀种于六孔板。

  2. 24h后,待细胞均匀铺满,用枪头比着直尺,垂直划一条直线,注意枪头要垂直,不能倾斜。注意保证实验组和对照组宽度相近。由于机械划痕时会对边缘的细胞造成损伤,可以选择购买划痕插件,即避免细胞损伤又能保证细胞宽度相同。

  3. PBS轻洗细胞3次,加入无血清培养基。

  4. 放入37度5%CO2培养箱。按0, 12,24小时取样,拍照。拍照时“划痕”的方向最好在视野内为水平的或者垂直的。

  二:检测细胞侵袭能力,最常用的实验方法为Transwell侵袭实验。

  (1)实验原理:利用一层膜(基质胶)将高营养的培养液和低营养的培养液隔开,细胞放在低营养的培养液里,为了寻找营养,细胞会往高营养的培养液里面迁移。主要是模拟细胞分泌金属蛋白酶消化细胞外基质,转移至其他组织的过程。由于只有具有侵袭能力的细胞才可进行Transwell侵袭实验。因此实验前最好先用明胶酶谱法检测MMPs的表达。

图例

  (2)实验步骤:

  1. 让细胞撤血清饥饿12-24h,去除血清的影响。

  2. 在无菌条件下将Matrigel胶冰浴融化。然后用无血清培养基稀释配制Matrigel ,比例1:4-1:8,稀释后在Transwell小室上室铺40ul/孔。

  3. 37℃放置2h,至Matrigel胶凝固,用无血清培养基水化30min。

  4. 用预热胰酶消化细胞,显微镜下观察细胞脱离培养皿形成单个或者团状的细胞,加入培养基终止消化反应。

  5. PBS轻洗细胞3次,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105细胞处理后,取10万细胞铺到上室。

  6. 48h后待细胞穿到下室,用棉签轻轻擦去基质胶和上室内的细胞。小室于室温彻底风干,以方便后一步染色。

  7. 0.1%结晶紫染色。

  8. PBS洗去多余结晶紫。

  9. Transwell小室与正置显微镜进行观察和拍照,随机选取多个视野进行细胞计数。

  三:检测细胞增殖能力,最常用的实验为CCK8增殖实验。

  注:科研小助手在之前详细讲解过MTT和CCK-8实验

  (1)实验原理:WST-8在电子耦合载体1-Methoxy PMS存在的情况下,可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲臜产物,颜色的深浅与细胞的增殖成正比,与细胞毒性成反比。对于许多肿瘤耐药株,可以在实验组与对照组加入药物处理后,可以通过cck8检测使用酶标仪在450nm波长处测定OD值,间接反映细胞活性。

  (2)实验步骤:

  1. 细胞消化为细胞悬液后,取 96孔板,每空加入100μL。置于培养箱预培养24小时(37℃,5% CO2)。在96孔板的四围可以加入PBS,防止细胞培养过程中液体蒸发过多。

  2. 12、24、48小时分别向培养板加入待测药物试剂。

  3. CCK8检测:

  (1)弃去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的100ul培养基,向每孔加入10μLCCK8溶液。其中预留的PBS孔加入CCK8作为空白组。

  (2)将培养板在37度培养箱内孵育1-4h。

  (3)酶标仪测定在450nm处的吸光度。

  细胞活性计算公式如下:

  细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100

  其中:

  A(加药):具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度。

  A(空白):具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度。

  A(0加药):具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度细胞活力。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1667.html

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