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细胞最佳感染MOI确定(附带常见问题解答)

2022-10-11 10:38:18
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  MOI(multiplicity of infection),即感染复数,指的是感染时病毒与细胞数量的比值。一般认为MOI是一个比值,没有单位,其实其隐含的单位是pfu number/cell。但对于某些病毒如AAV病毒,无法用pfu表示病毒的数量,而是采用TU、IU、病毒颗粒(viral particles, v.p)或基因组数量(vector genome,v.g.)来表示病毒数量。

  慢病毒(Lentivirus)载体是基于HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)的单链RNA病毒载体,可感染分裂或非分裂细胞,并将外源基因有效地整合到宿主染色体上,且具有较低的免疫原性,被广泛应用于各种体外细胞实验中。

  1.常见细胞MOI参考值(慢病毒)

图例

  2.慢病毒MOI值摸索步骤

  (1)实验前信息准备:

  目标细胞系培养条件及增殖速度

  排除细胞支原体污染

  查阅文献,获得目标细胞参考MOI值(如没有相关文献,则可首先设置较大梯度的MOI进行预实验)

  (2)MOI梯度设置:

  在查阅到的参考MOI值前后各设置2个梯度,每个梯度至少相差2倍

  举例:查阅到某细胞系在文献中慢病毒MOI应用为10,则设置MOI梯度为2.5-5-10-20-40。低于参考值1;低于参考值2;查阅到的MOI;高于参考值1;高于参考值2(可视情况省略此设置)2.5  5  10  20  40

  根据公式计算所需添加的病毒量:

  MOI值=病毒滴度(TU/mL)×病毒体积(mL)/细胞个数

  (3)铺细胞

  在96孔板中铺1×104个细胞/孔,培养基定容至100μL/孔;

  (4)慢病毒感染

  依据所计算出的病毒体积,逐个孔添加慢病毒,并于感染次日更换新鲜培养基。

  (5)确定MOI范围

  a.带荧光标签的慢病毒:观察荧光

  感染后72小时后,于荧光显微镜下观察细胞状态和荧光情况,确定细胞状态较好且荧光数较多的孔,对应为较适宜的MOI值。

  b.不带荧光标签的慢病毒:抗性筛选(puromycin/blasticidin等)

  查阅相应抗性素在相应细胞株中的筛选浓度,于感染后72小时加入药物,培养3-5天,镜下观察,选取细胞存活率较高且细胞状态较好的孔,对应为较适宜的MOI值。

  (6)缩小MOI范围进行二次摸索(附加步骤)

  如需较为精确的MOI值,可在步骤(5)中确定的MOI范围内再设置MOI梯度,实验方法同步骤(3)—(5)

  举例:第一次实验确定的最佳MOI范围:5 10

  第二次实验的MOI设置: 6 7 8 9

  3.慢病毒感染中的常见问题

  (1)怎样提高慢病毒的感染效率?

  细胞良好的生长状态是达到高感染效率的保证。必要时可在感染时加入助感染试剂ADV-HR来提高慢病毒的感染效率。

  (2)助感染试剂ADV-HR的使用浓度和使用方法是什么?

  助感染试剂ADV-HR能够显著提高慢病毒的感染效率,并呈现剂量  和时间依赖 效应。但较高浓度的ADV-HR具有细胞毒性,影响细胞  状态和感染效率。我们建议您务必于目的细胞中进行ADV-HR浓度梯度预实验。我们在HEK293中的实验表明,当ADV-HR使用浓度小于等于1.0×10-2mg/mL时,细胞状态良好。

  (3)慢病毒感染后为什么细胞中出现大量黑点,并影响细胞生长?

  在排除细菌及真菌污染后,细胞中的黑点通常为细胞碎片,导致细胞破碎的原因有很多,但在慢病毒感染后,细胞破碎通常有两个原因:

  a. 慢病毒使用量过多,或细胞数量过少;

  b. 支原体污染。由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长和增殖,故支原体污染被许多实验室所忽略。但支原体易在病毒感染细胞后爆发,故会出现大量细胞碎片。我们建议在使用病毒制品时,应首先排除细胞、培养物及培养环境中的支原体污染,以节约您的宝贵时间。


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