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病理实验:怎么提高慢病毒感染细胞效率?

2021-08-17 07:36:07
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  无论是基础研究还是临床应用,高纯度、高滴度的慢病毒都是非常理想的基因操作工具。然而由于慢病毒包装中使用的细胞类型不同,慢病毒感染的效率也会有差异,因此,选择合适的实验步骤和最佳的实验条件是提高慢病毒的感染效率的关键!

  常规的慢病毒感染细胞大致是这样的(以24孔板贴壁细胞为例):

  Day 0 接种细胞

  每孔按5×104个待感染细胞铺板,用含有 10% FBS的DMEM培养基培养;

  Day 1 细胞感染

  感染前,配置感染液备用,吸掉旧培养基,更换为感染液; 并参考细胞 MOI值,计算病毒使用量,加入病毒进行感染,混匀;

  Day 2

  病毒感染8-16h后,换回常规培养基,继续培养;

  Day 3-4

  感染72h后,显微镜下观察感染效果,如EGFP、Cherry的表达情况;

  整个细胞操作过程挺简单,但是也有一些需要注意的地方,咱们接着往下看。

  在细胞感染时,MOI是一个非常重要的指标。我们想提高感染效率,首先就是要确定细胞的最佳感染复数MOI。那么如何确定MOI值呢?我们先往下看。

  感染条件及MOI的选择原则:

  (1) 在细胞形态不受影响的情况下尽可能用少的病毒感染细胞

  (2) 选择感染效率80%左右的作为最佳感染条件

  通过细胞感染预实验可以知道慢病毒对细胞的最佳感染条件,来确定细胞的MOI,进行正式实验。

  具体的最佳感染复数MOI确定方法见另一篇文章:稳定表达细胞株的构建方法。

  如何解决细胞难感染的问题?

  慢病毒对细胞的感染效率受多个因素影响,如细胞自身生长的状态,细胞数量,细胞被慢病毒感染的难易程度等。因此保证细胞正常增殖,轮廓清晰,合适的细胞密度,选择最优的感染条件可以更好的保证感染效率。

  对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,可以通过添加病毒感染增强液来显著提高转染效率。(知恩生物慢病毒包装试剂盒内含病毒感染增强液,客户亦可单独购买)

  此外,对于悬浮细胞,可采用离心感染方法,减少病毒感染时的体积,从而进一步提高感染效率。如将细胞培养板密封后,用平角转子离心机1000g离心1h,再放回培养箱中正常培养。

  除了细胞感染难的问题,加入慢病毒后细胞大量死亡也是影响慢病毒感染效率的一个因素,当我们遇到这个问题时,该如何处理?

  慢病毒中的杂质是造成细胞毒性的主要因素。因此,我们可以采用调整并降低感染的MOI值,并且在感染后4小时、8 小时、12 小时对细胞进行观察;若发现细胞状态变差时,则需要立刻对细胞进行换液操作,使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。

  掌握以上这些小技巧,将更有利于提高慢病毒感染细胞的效率。

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