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实验外包:Western Blot实验常见问题

发布时间:2021-08-18 02:39:36 阅读:13212次 来源:本站

  在做Western Blot实验时,明明感觉自己已经严格按照步骤方法做的很好了,然而却为什么的不到自己满意的结果呢?其实每个人的实验习惯千差万别,只要掌握一些标准化的要领,小白也能独立的完成Western Blot实验。因此,针对Western Blot实验中可能出现的问题,我们做了一个比较细致的分析,相信这些能够帮助你更容易获得满意的结果。

  1.高背景问题的原因及解决办法

  ①抗体浓度太高

  答:优化/降低一抗和二抗的浓度

  ②抗体孵育温度过高

  答:4 ℃孵育

  ③二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应

  答:设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度

  ④一抗或二抗与封闭剂有交叉反应

  答:在孵育和洗涤液中加入 Tween-20 减少交叉反应

  ⑤封闭不充分

  答:延长封闭时间,更换合适的封闭剂(脱脂奶粉,BSA,酪蛋白等)

  ⑥抗体与其它蛋白质交叉反应

  答:更换不同的封闭液;勿在含生物素体系中使用脱脂奶粉封闭;降低二抗浓度;检测二抗与膜的交叉反应性

  ⑦洗膜不充分

  答:增加洗涤次数

  ⑧膜干燥

  答:保证充分的反应液,避免出现干膜现象

  2.弱信号或无信号

  ①抗体问题

  答:增加抗体浓度;抗体与抗原结合差;抗体丧失活性

  ②抗原不足

  答:增加上样量

  ③抗原被封闭液遮蔽

  答:试用不同的封闭液 ;优化封闭液中蛋白质浓度 ;缩短封闭时间

  ④蛋白质样品在储存过程中降解

  答:重新制备样品

  ⑤转膜不充分,或洗膜过度

  答:使用丽春红检测转膜效果,PVDF 膜需浸透,需正确的转膜操作,勿过度洗膜

  ⑥过度封闭

  答:使用含 0.5% 脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液,或更换封闭剂,减少封闭时间

  ⑦一抗失效

  答:使用有效期内抗体,分装保存,避免反复冻融取用, 工作液现配现用

  ⑧酶和底物失效

  答: 直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物,使用新鲜的底物

  3.非特异性条带

  ①一抗浓度过高

  答:在满足一定的敏感性的情况下,降低一抗浓度

  ②二抗引起的非特异条带

  答:免疫球蛋白是一个超家族,而标本中含有大量的类似球蛋白的抗原,容易和二抗引起反应,尤其是在变性的情况下,在满足敏感性要求的前提下,荧光标记一抗,酶标兔抗荧光就可以解决这个问题

  ③蛋白的降解

  答:这个和之前一样,重新制备样品

  ④上样量过高

  答:适当减少上样量

  ⑤洗涤不完全

  答;可适当延长洗涤时间

  ⑥封闭不好

  答:延长封闭的时间;选择更加适合的封闭液

  4.弥散型条带

  ①抗体浓度太高

  答:降低抗体浓度

  ②蛋白质上样量太多

  答:降低蛋白质上样量

  ③迁移过快、电泳温度过高

  答:降低电泳速度,低温电泳(冷室)

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/165.html

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