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常用的蛋白测量的方法,BCA法、考马斯亮蓝法(Bradford)和Lowry法实验解析

发布时间:2022-09-08 10:25:37 阅读:17732次 来源:百度学术

  蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一,承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础。目前常用的蛋白测量的方法主要有BCA法、考马斯亮蓝法(Bradford)和Lowry法等。

  BCA法

  原理

  在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+(biuret reaction)。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。

  实验步骤

  1.按试剂盒说明书配置BCA工作液;

  2.完全溶解蛋白质标准品,加到96孔板的蛋白标准品孔中,按照说明书要求对标品进行梯度稀释,加入BCA工作液,用酶标仪测定其吸光度;

  3.以样品浓度为X轴,吸光度为Y轴,绘制标准曲线;

  4.待测样品中加入BCA工作液,测定吸光度,带入标准曲线中,计算样品浓度。

  与Lowery法相比,BCA蛋白测定方法灵敏度高,操作简单,试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳,并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比,BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

  考马斯亮蓝法(Bradford)法

  原理

  考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

  实验步骤

  1.按试剂盒说明书配置Bradford染液;

  2.完全溶解蛋白质标准品,加到96孔板的蛋白标准品孔中,按照说明书要求对标品进行梯度稀释,加入染液和染料结合液后,用酶标仪测定其吸光度;

  3.以标品浓度为X轴,吸光度为Y轴,绘制标准曲线;

  4.各孔中加入染液和染料结合液,测定样品吸光度,带入标准曲线中,计算样品浓度。

  Bradford法试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,最小可测2.5μg/mL蛋白质。

  斐林—酚试剂(Lowry)法

  原理

  斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应,其中包括两步反应:第一步是在碱性条件下,与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物;第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原,生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物,颜色深浅与蛋白含量成正相关,在650nm波长下有最大光吸收。

  实验步骤

  与上述两种方法大致相同

  LORRY法灵敏度高,重复性好,适于5~l00μg蛋白质的定量,耗时长,操作要严格计时,在实验中要特别注意排除还原物质、柠檬酸等的干扰作用才能得到最准确的实验结果。

  这几种方法共同点在于,都需要绘制标准曲线,而标准曲线及待测样品往往数量较多,为了缩短实验耗时,保证测量准确性,可使用酶标仪对吸光度进行测定。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1566.html

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