细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养是―种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

　　一、实验材料

　　CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯、贴壁细胞株、完全培养基（RPML1640或DMEM），0.25%胰蛋白酶、PBS液。

　　二、操作步骤

　　（1）传代前准备

　　①预热培养用液：把已经配制好的培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37 ℃水浴锅内预热。

　　②消毒：用75%酒精棉球擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

　　③正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

　　④点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

　　⑤超净工作台内拆除已消毒空培养瓶的外包装。

　　⑥取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后放入超净工作台内。

　　⑦从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在显微镜下观察细胞。

　　⑧打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。

　　（2）胰蛋白酶消化

　　①加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37 ℃。

　　②显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

　　③终止消化：加入与消化液等体积的新鲜培养液。

　　（3）吹打分散细胞

　　①吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

　　②吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10 mL离心管中。

　　③平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000 r/ min离心5min。

　　④弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2 mL培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

　　（4）分装稀释细胞

　　①分装：将细胞悬液吸出分装至2~3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶。

　　②显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105个/mL。做好标记。

　　（5）继续培养

　　用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2h后开始贴附在瓶壁上。

　　三、注意事项

　　①严格的无菌操作。

　　②适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。