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贴壁细胞传代培养操作步骤及注意事项解析

发布时间:2022-08-25 10:27:12 阅读:17192次 来源:百度学术

  细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养是―种将细胞种保存下去的方法,同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

  一、实验材料

  CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯、贴壁细胞株、完全培养基(RPML1640或DMEM),0.25%胰蛋白酶、PBS液。

  二、操作步骤

  (1)传代前准备

  ①预热培养用液:把已经配制好的培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37 ℃水浴锅内预热。

  ②消毒:用75%酒精棉球擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

  ③正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。

  ④点燃酒精灯:注意火焰不能太小。

  ⑤超净工作台内拆除已消毒空培养瓶的外包装。

  ⑥取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后放入超净工作台内。

  ⑦从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在显微镜下观察细胞。

  ⑧打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。

  (2)胰蛋白酶消化

  ①加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37 ℃。

  ②显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。

  ③终止消化:加入与消化液等体积的新鲜培养液。

  (3)吹打分散细胞

  ①吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

  ②吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10 mL离心管中。

  ③平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000 r/ min离心5min。

  ④弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2 mL培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

  (4)分装稀释细胞

  ①分装:将细胞悬液吸出分装至2~3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶。

  ②显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105个/mL。做好标记。

  (5)继续培养

  用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2h后开始贴附在瓶壁上。

  三、注意事项

  ①严格的无菌操作。

  ②适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1516.html

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