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ELISA标本处理时要注意什么(ELISA实验操作注意事项)

发布时间:2022-10-31 10:44:39 阅读:11292次 来源:生物实验菌

  ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay酶联免疫吸附测定法)是免疫学中的经典实验。ELISA的基础是抗原的固相化及抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原仍保持其免疫学活性,酶标记的抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。

  在检测时,受检标本(测定其中的抗原)与固相载体表面的抗体反应。洗涤后加入酶标记的抗体,通过反应结合在固相载体上。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

  由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。

  一、ELISA样本的处理

  ELISA检测的目的是为实验提供准确可靠的定量分析实验依据。

  样本处理的注意事项

  ➊ 每个标本量收集体积= 100ul × 检测种类,如要做复孔,标本量收集体积=100ul ×检测种类×2 。

  ❷ 对于作某一个具体指标来说,最好先用一系列稀释度作一批标本测定,得出对实验有意义的一个稀释度(即测定剂量反应曲线),然后用一个最适稀释度测定即可。

  ❸ 收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本,储存在 4 ℃ 备用,如有特殊原因需要周期收集标本,将标本及时分装后放在 -20 ℃ 或 -70 ℃ 条件下保存。避免反复冻融。标本 2 -8 ℃ 可保存 48 小时, -20 ℃ 可保存 1 个月。-70 度可保存 6 个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。

  ❹ 血清标本采集时,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。

  ❺ 为了保证尿液检测结果的准确性,必须正确收集尿液标本和保存。盛尿容器要清洁干燥。最好使用一次性的容器(如塑料尿杯),避免因用药并清洗不干净而造成的污染,影响检测结果。尿液标本必须新鲜,留取后,应及时检测或保存,以免细菌繁殖。因在室温中久置后(尤其是夏季)尿中磷酸盐等可析出结晶而干扰检测。

  ❻ 标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反

  应。保存过久可发生聚合在ELISA中可使本底加深。

  ❼结标本融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,避免气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。

  ❽混浊或有沉淀的标本应先离心或过滤,澄清后再检测。

  ❾反复冻融会使蛋白效价降低,所以待测标本如需保存作多次检测,宜少量分装冻存。

  二、标本类型

  01

  ELISA常见标本

  ➊ 液体类标本:包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

  ❷ 培养细胞

  ❸ 组织标本

  02

  标本的保存

  ➊ 一般说来,在5天内测定的标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冻存。

  ❷对收集后当天进行检测的标本,储存在 4 ℃ 备用,如有特殊原因需要周期收集标本,将标本及时分装后放在 -20 ℃ 或 -70 ℃ 条件下保存。避免反复冻融。

  ❸标本 2 -8 ℃ 可保存 48 小时, -20 ℃ 可保存 1 个月。-70 度可保存 6 个月。部分标本也可加入适当防腐剂,激素类标本需添加抑肽酶。

  03

  标本的处理

  可用作ELISA测定的标本十分广泛,体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液)、细胞培养上清、细胞、组织等均可作标本以测定其中某种成份。有些标本可直接进行测定,有些则需经预处理。

  ➊ 血清

  室温血液自然凝固 10-20 分钟后,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。收集上清。如有沉淀形成,应再次离心。

  ❷血浆

  应根据试剂盒的要求选择 EDTA 、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,加入 10 %( v/v )抗凝剂 ( 0.1M 柠檬酸钠或 1% heparin 或 2.0%EDTA.Na2) 混合 10-20 分钟后,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。如有沉淀形 成,应再次离心。

  ❸尿液、胸腹水、脑脊液

  用无菌管收集。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。如有沉淀形成,应再次离心。

  ❹细胞培养上清

  检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。检测细胞内的 成份时,用 PBS ( PH7.2-7.4 )稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

  ❺细胞

  检测细胞的成份时,对于贴壁细胞,去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞10 秒后,细胞就会被裂解。对于悬浮细胞,离心收集细胞,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍.加入适量裂解液, 用枪吹打把细胞吹散。用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装然后再裂解。充分裂解后,10000-14000g离心3-5 分钟,取上清,即可进行后续操作。

  ❻组织标本

  切割标本后,称取重量。加入一定量的 PBS或组织蛋白萃取试剂,缓冲液中可加入蛋白酶抑制剂。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清置于 -20 度或 - 70 度保存,如有必要,可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

  三、ELISA的检测方法

  ELISA的检测方法有直接法、间接法、竞争法及双抗夹心法。其中直接法和竞争法应用较少,应用最多的是双抗夹心法,其在敏感性及特异性上有明显的优势。

  01

  直接法(direct ELISA)

  将抗原直接固定在固相载体上,加入酶标记的一级抗体,即可测定抗原总量,此一级抗体的特异性非常重要。

  》优点:操作手续简短,因无须使用二抗可避免交互反应。

  》缺点:试验中的一抗都得用酶标记,但不是每种抗体都适合做标记,费用相对提高。

  02

  间接法(indirect ELISA)

  此测定方法与直接法类似,差别在于一级抗体没有酶标记,改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。

  》优点:二抗可以加强信号,而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。

  》缺点:交互反应发生的机率较高。

  03

  竞争法(competitive ELISA)

  小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。

  》优点:适用于小分子抗原,数据再现性很高。

  》缺点:整体的敏感性和特异性都较差。

  04

  夹心法(sandwich ELISA)

  被检测的抗原包被在两个抗体之间,其中一个抗体将抗原固定于固相载体上,即捕捉抗体。另一个则是检测抗体,此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量;或不标记,再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体必须小心选取,才可避免交互反应或竞争相同的抗原结合部位。

  》优点:高灵敏、高特异性,抗原无须事先纯化。

  》缺点:抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。

  四、双抗夹心法的操作步骤

  01

  ELISA实验注意事项

  ➊正式实验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

  ❷在ELISA中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:

  (1) 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。

  (2) 包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18~24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。

  (3)酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

  (4)酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是H2O2在临用前加入。

  02

  ELISA实验的几点建议

  ➊加样

  加样速度尽量要快,避免酶标板干燥。加样时, 移液器垂直向下,加在包被孔的底部,同时避免碰壁触底。

  ❷孵育

  温度严格控制在37℃,不可过高或过低。孵育时,将酶标板封闭完好,避免将酶标板放在环境温度变化大的地方。避免酶标板堆叠 。

  ❸洗涤

  洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中,洗涤是最主要的关键技术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格按要求洗涤,不得马虎。

  洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外,手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种,过程如下:(1)浸泡式:a.吸干或甩干孔内反应液;b.用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去);c.浸泡,即将洗涤液注满板孔,放置1-2min,间歇摇动,浸泡时间不可随意缩短;d.吸干孔内液体。吸干应彻底,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;e.重复操作c和d,洗涤3-4次(按说明规定)。在间接法中如本底较高,可增加洗涤次数或延长浸泡时间。微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而削弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20,其浓度可在0.05%-0.2%之间,高于0.2%时,可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。

  (2)流水冲洗式:流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤,洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置,使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗,持续冲洗2min后,吸干液体,再用蒸馏水浸泡2min,吸干即可。浸泡式犹如盆浴,流水冲洗式则好比淋浴,其洗涤效果更为彻底,且也简便、快速。已有实验表明,流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压,让水流冲击板孔表面,洗涤效果更佳;

  总结一点就是:洗液需要现配现用,配制洗液应用新鲜的和高质量的超纯水或双蒸水。洗板机洗板时,保证洗液注满各孔,洗板针畅通。手动洗板时,加洗液要快速,没有多道移液器可以使用洗瓶,浸泡后甩板倒液要迅速干脆,倒液后在吸水纸上拍板。需要用力拍板,使孔内没有可见液体挂壁,但也不能太重,不能让样品干太久。洗板时,每孔至少加300ul洗液。

  ❹显色和比色

  显色

  显色是ELISA中的最后一步温育反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中,加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行,时间一般不需要严格控制,有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间,及时判断。

  OPD底物显色一般在室外温或37℃反应20-30min后即不再加深,再延长反应时间,可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色,显色反应应避光进行,显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后,显色由橙黄色转向棕黄色。

  TMB受光照的影响不大,可在室温中置于操作台上,边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性,宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后,约40min显色达顶峰,随即逐渐减弱,至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种,叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪,是目视判断的良好终止剂。此外,各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。

  一般来说:肉眼可见标准品前3-4孔有明显的梯度蓝色时,就可终止反应。加终止液时避免出现气泡 。

  比色

  比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体,但应尽量避免刮花表面,然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验,需先将板置于标准96孔的座架中,才可进行比色。最好在加底物液显色前,先将软板边缘剪净,这样,此板就可完全平妥坐入座架中。

  比色时应先以蒸馏水校零点,测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔),以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点,以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度,然后进行计算。

  比色结果的表达以往通用光密度(oplical density,OD),现按规定用吸光度(absorbence,A),两者含义相同。通常的表示方法是,将吸收波长写于A字母的右下角,如OPD的吸收波长为492nm,表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。

  ❺酶标比色仪

  酶标比色仪简称酶标仪,通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同,各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有:测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001,准确性为±1%,重复性达0.5%。举例说,若某孔测得的A值为1.083,则该孔相对于空气的真实A值应为1.083± 0.01(1.073~1.093),重复测定数次,其A值均应1.083±0.05(1.078~1.088)在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.000~2.000,新型号的酶标仪上限拓宽达2.900,甚至更高。超出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同,线性范围常小于可测范围,比如某一酶标仪的可测范围为0.000~2.900,而其线性范围仅0.000~2.000,这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。

  酶标仪不应安置在阳光或强光照射下,操作时室温宜在15~30℃,使用前先预热仪器15-30min,测读结果更稳定(也有一些酶标仪说明书上明确标明不需要预热)。

  测读A值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读,即每孔先后测读两次,第一次在最适波长(W1),第二次在不敏感波长(W2),两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OPD用492nm为W1,630nm为W 2,最终测得的A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

  各种酶标仪性能有所不同,使用中应详细看使用说明书。

  结果判断

  定性测定

  定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无"的简单回答,分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果,即用滴度来表示反应的强度,其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中,将标本作一系列稀释后进行试验,呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低,可以判断标本反应性的强弱,这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。

  在间接法和夹心法ELSIA中,阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反,阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同,分述于下。

  ( 1 )间接法和夹心法

  这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性,显色清晰者为阳性。但在ELSIA中,正常人血清反应后常可出现呈色的本底,此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异,因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判断结果时,更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。

  目视法简捷明了,但颇具主观性。在条件许可下,应该用比色计测定吸光值,这样可以得到客观的数据。先读出标本(sample,S)、阳性对照(P)、和阴性对照(N)的吸光值,然后进行计算。计算方法有多种,大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。

  a.阳性判定值

  阳性判定值(cut-off value)一般为阴性对照A值加上一个特定的常数,以此作为判断结果阳性或阴性的标准。

  用此法判断结果要求实验条件十分恒定,试剂的制备必须标准化,阳性和阴性的对照品应符合一定的规格,须配用精密的仪器,并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆,阳性对照品HBsAg的含量标明为P=9±2ng/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后,先计算阴性对照A值的平均数(NC X )和阳性对照A值的平均数(PCX),两个平均数的差(P-N)必须大于一个特定的数值(例0.400),试验才有效。3个阴性对照A值均应≥0.5×NCX,并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范围,则弃去,而以另两个阴性对照重新计算NCX;如有两个阴性对照A值超出以上范围,则该次实验无效。阳性判定值按下式计算:

  阳性判定值=NCX+0.05

  标本A值>阳性判定值的为阳性,小于阳性判定值的为阴性。应注意的是,式中0.05为该试剂盒的常数,只适合于该特定条件下,而不是对各种试剂均可通用。

  根据以上叙述可以看出,在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用,试剂变质和操作不当均会产生"试验无效"的后果。

  b.标本/阴性对照比值

  在实验条件(包括试剂)较难保证恒定的情况下,这种判断法较为合适。在得出标本(S)和阴性对照(N)的A值后,计算S/N值。也有写作P/N的,这里的P不代表阳性(positive),而是病人(patient)的缩写,不应误解。为避免混淆,更宜用S/N表示。在早期的间接法ELISA中,有些作者定出S/N为阳性标准,现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N的阈值。更应注意的是,N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液,以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此,这类试剂盒规,如N<0.05<>(或其他数值),则按0.05计算,否则将出现假阳性结果。

  ( 2 )竞争法

  在竞争法ELISA中,阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量,一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间,此时反应最为敏感。

  竞争法ELISA不易用自视判断结果,因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异,一般均用比色计测定,读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种,即阳性判定值法和抑制率法。

  a. 阳性判定值法

  与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同,但在计算公式中引入阳性对照A值,现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆,阳性对照中抗HBc含量为125±100u/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后,先计算阴性对照A值的平均值(NC X )和阳性对照A值的平均数(PCX),两个平均数的差(N-P)必须大于一个特定的数值(例如0.300),试验才有效。3个阴性对照A值均应小于2.000,而且应≥0.5×NCX并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范围,则弃去,而以另2个阴性对照重新计算×NCX;如有2个阴性对照A超出以上范围,则该次实验无效。阳性判定值按下式计算:

  阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

  标本A值≤阳性判定值的反应为阳性,A>阳性判定值的反应为阴性。

  b. 抑制率法

  抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度,按下式计算:

  抑制率(%)= (阴性对照A值-标本A值)×100%/阴性对照A值

  一般规定抑制率≥50%为阳性,<50%为阴性。

  定量测定

  ELSIA操作步骤复杂,影响反应因素较多,特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致,因此在定量测定中,每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA,标准曲线的范围一般较宽,曲线最高点的吸光度可接近2.0,绘制时常用半对数纸,以检测物的浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,将各浓度的值逐点连接,所得曲线一般呈S形,其头、尾部曲线趋于平坦,中间较呈直线的部分是最理想的检测区域。

  测定小分子量物质常用竞争法,其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。

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