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实验性牙周炎动物模型的构建方法(常见的牙周炎动物模型有哪些)

2022-08-22 10:36:37
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  牙周炎是一种病因较复杂的口腔常见病,可导致牙龈组织逐渐丧失,逐渐损害牙周韧带及牙槽骨,是造成成年人牙齿丧失的最主要原因。

  目前普遍认为菌斑微生物及其产物在局部的堆积和浸润是牙周炎发生、发展的关键因子,而机体对此的应答反应则是决定牙周炎发生与否、发病速度、病变程度以及范围的重要因素。

  研究疾病与宿主间的联系是非常重要的,牙周炎动物模型的正确建立,对深入探讨牙周炎的发病机制、病理学特点以及预防、治疗牙周炎等均有重要意义。

  接下来,本文将从模型动物的选择和构建方法这2方面进行详细阐述,以提高牙周炎动物模型构建成功率。

动物的选择

  牙周炎动物模型的建立过程中实验动物起着很关键的作用,所选用的动物不仅要与人类牙周组织结构、病理过程相似,且要形体适中、经济易得,便于造模。

  目前,可用于建立牙周炎的动物有多种,如:大鼠、豚鼠、金地鼠、田鼠、猫、犬、家养雪貂、兔、羊、小型猪和非人灵长类(如猴),其中非人灵长类、犬、大鼠较常用于牙周炎模型的研究。

  01 大鼠

  大鼠牙龈的结构与人类极为相似,其牙周病的组织病理表现也与人近似,再加上其体型小、繁殖率高、价格便宜、易于饲养及操控,有足够的数量进行研究和统计分析,因此是目前应用最多的牙周炎实验动物。

  但大鼠牙周病发病率远低于人,且牙齿小,对操作和观察有一定影响,同时因大鼠的牙齿能持续不断的生长,只适合短时程的实验研究。

  02 非人灵长类

  非人灵长类其口腔及牙齿结构与人类极为相似,可以自发地形成牙菌斑、牙结石、口腔微生物致病菌,牙周炎易感性高,是牙周炎研究最适合的模型动物。但因属于自然保护动物,价格昂贵,不易购买,且繁殖较慢,易感染结核,在大规模实验研究中的应用受到较大的限制。

  03 小型猪

  小型猪的口腔和颌面部结构与人类的解剖学、生理学和疾病的发展相似,小型猪经常自发不同程度的牙龈炎,疾病进展模式与人类相同:牙龈肿胀,菌斑积聚,牙结石形成以及牙龈出血,并在组织学上伴有炎症细胞浸润和血管舒张,后可能发展为严重的牙周炎症。然而,其价格昂贵,饲养条件要求较高,其应用受到限制。

  04

  犬的牙周组织结构以及牙周炎的病理学特点均与人相似,牙面常有牙石沉积,可以发生自发性牙周炎,是研究自然发生的牙龈炎和牙周炎合适的模型。一般选择全身发育良好,年龄1岁左右,体重12-15kg的犬建立牙周炎模型。但由于犬攻击性强,价格相对昂贵,需要特殊的日常照顾,存在饲养问题,牙周病变程度和部位不均匀等特点限制了其在牙周病研究的应用。

  05 其他动物

  ①由于小鼠牙齿细小,且每只只能提供微量的牙龈组织,因此实验时需要扩大样本量。且小鼠口腔和牙齿的小尺寸,将结扎物放置在小鼠牙齿周围的技术上的困难。

  ②兔口腔中有大量与人类相同的病原菌,菌群分布与致人牙周病的菌群相似,可较准确地模拟人类口腔疾病状态。除在牙齿周围进行可重复的牙周炎症研究外,兔的主要优点是单独结扎不会引起软组织或硬组织破坏。因此,与大鼠和小鼠相比,其可用于测试人类牙周病病原体的特定影响。

  ③羊具有自发性牙周炎的临床特征和血清学特点,口腔微生物情况与人牙周炎极相似,但因其空间需求大、成本高、难控制,一般较少使用。

  ④雪貂会自然发生与人类相似的牙结石和牙周病,是研究牙结石的适宜模型,但其易从标准笼中脱出,需要特殊管理。

常见的牙周炎动物模型

  牙周炎病因学研究显示外源性和内源性两大因素构成牙周炎的发生。外源性因素主要包括口腔卫生、牙结石、食物嵌塞等,它促使菌斑积聚,细菌侵表。内源性因素主要包括免疫缺陷、内分泌失调、代谢紊乱等,它与外源性因素共同参与发病过程。因此、牙周炎的动物模型也要围绕内、外源因素进行复制可以根据研究的具体内容增减致病因素。

  单纯局部结扎、接种致病微生物、高糖黏性饲料喂饲、改变免疫状态、扰乱内分泌以及多种因素联合作用均能构建出相应的牙周病动物模型。

  01 结扎法

  结扎线法诱导大鼠牙周骨丢失首次描述于1966年,目前单纯利用该法构建动物牙周炎模型的技术已相当成熟,在各种牙周病的研究中均得到广泛使用。

  常用的实验动物是大鼠和小鼠,结扎材料有尼龙线、细丝线、橡皮圈、正畸用钢丝等,一般结扎在实验动物的牙颈部或龈沟内,造成牙龈与牙颈部菌斑的持续累积,炎症细胞的持续浸润,从而使牙周炎持续发展,最终造成牙槽骨吸收。

  此外,结扎时需要对牙颈部的牙龈组织进行轻度剥离,从而对牙龈牙周组织造成机械损伤,进一步导致牙周结缔组织破坏和牙槽骨丢失,从而实现动物牙周炎模型的建立。

  近年来大量研究显示,采用单纯结扎法通常在1-4周内实验牙即出现明显的牙龈红肿、牙周袋形成、探诊出血、菌斑堆积和牙槽骨吸收现象,且腭侧结扎引起的骨丢失较颊侧更为可靠。

  该造模方法价格低廉、手术操作简单,实验可重复性高,成功率更高。牙颈部的结扎线促进龈下菌斑堆积,可模拟单纯由菌斑引起的慢性牙周疾病。该模型已被广泛应用于牙周炎的防治及发病机制等项目研究。

  另外,结扎钢丝放于龈下,除了起到“菌斑滞留器”的作用之外,还可造成牙龈区的机械损伤,牙周组织的完整性遭到破坏,宿主与菌斑之间的交互作用增强,有利于缩短病变模型形成的时间。

  不过需要注意的是,在建模过程中要定期检查结扎材料是否脱落,或根据需要进行更换。另外,不同的结扎材料可能允许不同质和量的细菌围绕结扎线在牙表面生长,因此可能会影响牙周炎的病程。

  02 接种牙周致病菌

  此方法通过在动物口腔中的靶向部位或牙龈边缘进行接种牙周炎致病菌,使细菌或炎性细胞浸润牙周组织。

  龈下复杂的菌斑微生物是引发牙周炎的始动因子,其通过直接破坏以及引发的宿主炎症反应导致大部分组织破坏。造成口腔微生物-宿主生态失衡的至关重要的低丰度细菌如伴放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌等目前被称为关键病原体。(如牙龈卟啉单胞菌可以干扰宿主免疫力,并使异常生物群落出现,其也是目前建立动物牙周炎模型使用最为广泛的菌种。)

  通过直接注射、局部涂抹或含菌食物嵌塞,将致病菌接种至动物口腔均能诱导实验动物产生牙周炎。

  该造模方法操作简单,单菌就能诱导牙周炎的发生,多菌引起的感染更严重。

  但与自发性牙周炎背道而驰,人的牙周炎发生过程是细菌从外部不断侵蚀入内,是由表入里,而不是由内致外。

  03 注射脂多糖

  革兰阴性细菌是目前公认的最主要的牙周致病菌,而脂多糖(LPS)组成了这类细菌的细胞壁。研究发现,外膜中的脂多糖具有强毒性和抗原性,易引发牙周炎,因此也可直接采用脂多糖诱导动物牙周炎产生。

  将纯化的细菌LPS用微量注射器,在上颌第一磨牙的腭侧或下颌第一、第二磨牙的牙间乳头进行注射,每周3次,最早在注射7天后就能发现牙槽骨丧失。

  此模型造模时间短,成功率高,病理学结果与牙周炎相似,但需要使用特殊的注射仪器,多和其他方法联合使用。

  04 高糖黏性饲料喂养

  高糖黏性食料喂饲最早由国外学者发现并验证,采用高糖低蛋白饲料饲养时,实验动物会有牙周袋产生、牙槽骨吸收和炎性细胞浸润等病理变化。

  黏性软食在牙齿局部的黏附和嵌塞不利于牙的自洁,可加剧菌斑的附着和累积;另外,高血糖通过削弱牙龈的免疫力,一定程度上降低了牙周组织的抗感染能力,进而引发炎症。

  该造模方法操作简单,重复性好,动物可出现牙菌斑并引起牙周炎,与临床上牙周炎患者表现相似,可用于探讨牙周病炎症损害的病因、临床过程以及药物筛选方面的研究。

  不过,单独使用此法建模效果一般,且造模周期稍长,因此可与其他方法联合使用。

  05 植入牙石法

  在一项针对牙周病患者的长期调查中发现,牙石在引起成人牙周病的因素中排名第2,仅次于菌斑,提示利用牙结石诱发牙周炎症的可能性。

  牙结石对牙周组织持续刺激,导致炎症反复发作,同时牙结石压迫牙龈,影响血液循环,造成牙周组织病菌感染,引发牙龈炎症及萎缩,形成牙周袋,导致食物残渣、菌斑和牙石等更易堆积,从而形成恶性循环,该方法虽然已在部分实验动物如兔、大鼠中得到了验证,但目前根据该方法建立牙周炎模型的研究少见,可能与其可控性小、病程与人自然发病过程相悖等有关。

  06 综合方法

  单一方法构建模型虽然操作简便,但并不能很好地模拟人发病过程中诸多因素的相互作用,与真实情况存在较大差异,实验周期一般较长,可控性也相对差。

  随着动物牙周炎模型的日趋成熟,越来越多的学者青睐于多种方法联合应用建模,以达到不同的实验目的。一项对比实验证明,两种或两种以上因素的联合刺激有助于缩短实验周期,提高建模效率。

  常见的方法有结扎法+高糖喂养、细菌接种+高糖喂养、细菌感染+结扎法、黏结牙石+细菌接种等,通常以一种因素的作用为主,其他因素辅助加重和加快牙周炎症进程。在此过程中,各种因素不仅相互促进,而且在一定程度上弥补了彼此的局限性。

  综上,牙周炎动物模型的建立可采用不同方法,若采用某种单一方法进行牙周炎动物模型的构建会导致病变局限,忽略了全身性因素的影响,而多个因素同时运用,有利于建立快速、稳定的牙周炎模型。

  目前牙周炎动物模型研究报道较多,由于这些模型在模拟类似人类牙周炎临床损害方面,它们均存在不同程度的优缺点,研究者必须根据实验目的和要求来选择模型。

  参考来源:

  [1]. 牙周炎动物模型的研究进展,刘小熙等,2017

  [2]. 牙周炎动物模型的研究进展,孔晨等,2019

  [3]. 人类疾病动物模型(第2版),刘恩岐主编,2014年

  [4]. 人类疾病动物模型复制方法学,周光兴等主编,2008

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