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免疫共沉淀(co-IP)的具体步骤

2022-07-28 10:21:14
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  免疫共沉淀(co-IP)的具体步骤:

  1. 细胞用预冷的PBS液洗涤2次,最后洗涤完成后吸干PBS液。

  2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)。

  3. 刮留细胞:用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下,将悬液转入1.5mlEP管中,EP管插冰上,置于水平摇床上缓慢晃动15min。

  4. 4℃,14000g离心15min。

  5. 立即将上清液转移到一个新的离心管中。

  6. 准备Protein A琼脂糖,用PBS液洗两遍珠子,然后用PBS液配制成50%浓度。

  *为避免操作中破坏琼脂糖珠,减掉移液器枪头的尖部分。

  7. 每ml总蛋白中加入100ul Protein A琼脂糖珠(50%),EP管插冰上,置于水平摇床上4℃摇晃10min。

  *目的是去除非特异性杂蛋白,可降低背景。

  8. 4℃,14000g 离心15min,将上清转移到一个新的离心管中。

  9. 测定蛋白浓度,可选用Bradford法做蛋白标准曲线。

  10. 蛋白定量,分装,-20℃保存,可保存1个月。

  11. 用PBS液将总蛋白稀释至约1ug/ml。

  12. 加入500ul稀释好的兔抗到总蛋白中。

  13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物,可选择过夜或室温放置2h。

  14. 加入100ul Protein A琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物,摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。

  15. 14000rpm瞬时离心5s,去上清,收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。

  16. 用800ul预冷RIPA buffer冲洗3遍。

  17. 用60ul 2倍上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻敲打混匀。

  18. 将上样样品煮5min。

  19. 14000g离心,收集剩余琼脂糖珠。

  20. 将上清电泳,电泳前应再次煮5min变性。

  21. 上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳。

  基础成分

  (1)Tris-HCl(防止蛋白变性的缓冲液成分)

  (2)NaCl(防止非特异性蛋白聚集的盐分)

  (3)NP-40(用H2O配置成10%储存液。NP-40为非离子去污剂,用于提取蛋白)

  (4)去氧胆酸钠(用H2O配置成10%储存液;提取蛋白用离子去污剂;避光保存)

  *因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失,准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠。

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