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基因改造项目磷酸钙转染法,磷酸钙转染法的原理

2022-07-19 10:42:37
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  要想将外源基因从细胞外导入到靶细胞中改造其基因,除了之前介绍的显微注射法和电穿孔技术之外,本节将介绍第三种技术:磷酸钙转染法。

  磷酸钙转染法的原理是:借助形成一种DNA-磷酸钙沉淀物,使其粘附于细胞表面,进而通过细胞对该沉淀物的内吞作用而使DNA被细胞捕获。此方法可广泛用于转染多种类型的真核细胞,不但适用于外源DNA在靶细胞中的短暂表达,也适用于外源DNA整合到靶细胞的染色体中形成稳定的转化产物。

  如上文所述,要借助磷酸钙颗粒将DNA导入细胞之中,首先需要制备磷酸钙-DNA共沉淀复合物。制备磷酸钙-DNA的过程一般分为两步执行:

  1,将DNA溶液与CaCl2溶液混合,此时DNA中带负电的磷酸根基团可与CaCl2中带正电的钙离子通过静电作用结合;

  2,将上述混合液逐滴加入磷酸盐缓冲溶液HBS中,充分吹打混匀,静置两分钟,磷酸钙沉淀形成。

  具体操作过程见下图1:

图例

  由于磷酸钙-DNA沉淀颗粒的大小和质量对于转染效率的影响很大,所以实验过程中往往要控制好各种参数(如在混合滴加过程中用空气吹打等),或者通过一些其他的优化条件(如在磷酸钙-DNA复合物颗粒表面包裹一层鱼精蛋白等),以确保形成尽可能细小的沉淀物(因为成团的DNA不能有效地粘附和进入细胞)。

  如上图1中所示:待磷酸钙-DNA复合物的小颗粒悬液生成之后,将此悬液逐滴加入正在培养的待转染的细胞的培养液中、并轻轻摇匀,随后这些颗粒便可吸附于细胞膜,进而通过胞吞作用进入细胞。磷酸钙-DNA复合物颗粒进入细胞作用的过程见下图2:

图例

  如图2中所示,磷酸钙-DNA复合物颗粒先是通过静电作用吸附于细胞膜,随后细胞膜内陷并形成小囊泡将此复合物颗粒吞入细胞之中。进入细胞之后的小囊泡与细胞内的溶酶体融合从而破裂,使得磷酸钙-DNA复合物颗粒得以释放入细胞质中,而DNA也因被磷酸钙所包裹从而免除被细胞内的核酸酶酶切降解。最终,DNA进入细胞核并整合于染色体上,发挥其改造靶细胞基因的作用。

  虽然相比病毒载体,磷酸钙转染法的转染效率比较低 ,但是其安全性能是病毒载体所无法比拟的。磷酸钙颗粒由于具有能穿过胞膜、在细胞里溶解这一特性,而成为热门的基因传递工具。其在自我降解过程中不会产生任何有毒的化学物质,颗粒的大小也是可变的,生产成本比较低,所以磷酸钙作为一种运输载体,极具发展前景。目前科学家们正从各个方向上积极研究以提高磷酸钙转染的效率以及优化这种方法的稳定性和重复性,并取得了丰硕的成果。

  参考文献:

  1,《改性磷酸钙纳米基因载体的研究》;作者:汪涛。


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