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质粒转染细胞实验具体操作步骤(以24孔板培养的哺乳动物细胞为例)

2022-07-20 10:24:36
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  转染(transfection)是细胞在一定条件下主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。质粒转染对于哺乳细胞蛋白的表达至关重要,转染的方法和步骤直接影响着转染的成功与否。现在一起学习一下质粒转染的具体步骤:

  以24孔板培养的哺乳动物细胞为例:

  1、种细胞;

  a、贴壁细胞:转染前一天每孔0.5-2×10E5个细胞接种于500ul培养基中,在转染时细胞可长至90-95%汇合度。

  b、悬浮细胞:在配置转染液前每孔4-8×10E5个细胞接种于500ul培养基中。

  2、转染液配置,每孔细胞用量如下:

  A. 用50ul无血清培养基稀释质粒DNA,轻轻混匀。

  B. 取适量合适的质粒转染试剂在50ul无血清培养基中稀释,室温孵育5min。

  C. 将前两步所稀释的DNA和质粒转染试剂混合,轻轻混匀,室温放置30min。

  3、在每孔细胞中加入混合后的转染液,轻轻摇匀。

  4、贴壁细胞可在转染4-6h后更换完全培养基,悬浮细胞可在转染后18-48h间进行细胞换液,转染18-48h后可检测基因mRNA水平表达。如果检测蛋白表达,需在转染后48-72h收集细胞样品。

  5、对于稳定转染,在转染24h后以1:10传代培养,第二天可加入选择培养基。

  作者:维真生物

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