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流式细胞术原理及应用(流式细胞术基本原理与实用技术)

2022-06-19 10:39:04
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  浅谈流式细胞术原理与应用

  流式细胞术(Flow cytometry,简称FCM)是一种基于流式细胞仪通过检测偶联荧光信号快速、准确、客观,并且同时检测单个微粒(通常是细胞或者颗粒)的多项特性技术,同时可以对特定群体进行分选。早期流式细胞术主要用于定性,后续慢慢发展为多参数定性、定量以及分选的技术。

  01流式细胞术的发展

  流式细胞术是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术,80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。我国在80年代初引进了首台流式细胞仪。具体发展历程如下[1]:

  1930年,Casperrsson和Thorell开始致力于细胞的计数;

  1934年,Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人,他试图用光电仪记录流过1根毛细管的细胞数量;

  1936年,Caspersson等引入显微光度术;

  1940年,Coons提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白;

  1947年,Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器;

  1949年,Coulter提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利;

  1950年,Caspersson用显微分光光度计在紫外(UV)和可见光光谱区检测细胞;

  1953年,Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理,成功地设计红细胞光学自动计数器;

  1953年,Parker和Hutcheon描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形;

  1954年,Beirne和Hutchcon发明光电粒子计数器; 1959年,B型Coulter计数器问世;

  1965年,Kamemtsky等提出两个设想:(1)用分光光度计定量细胞成分;(2)结合测量值对细胞进行分类;

  1967年,Kamemtsky和在.Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法;

  1969年,Van Dilla Fulwyler及其同事们在LosALmos,NM(现在的National Flow Cytometry Resource Labs)发明首台荧光检测细胞计;

  1972年,Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型,能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号;

  1975年,Kochler和Milstein提出单克隆抗体技术,为细胞研究中大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础。

  02流式细胞术的三大要素

  1.流式细胞仪:现在市面上有多种型号的流式细胞仪,但其基本结构都是相同的,分析性流式细胞仪有液流系统、光路系统、监测分析系统。

  流式细胞仪原理::在一定的压力下,鞘液带着细胞或者微粒通过喷嘴中心进入到流式照射室,在流式照射室的分析点,激光照射细胞并发生散射和折射,发射出散射光,同时被荧光标记的颗粒发射出荧光。散射光和荧光分别被不同的检测器接收,通过光电倍增管将检测到的荧光信号转换成电信号,这些电信号放大后再经过数据化处理输入电脑,供我们进行分析。

  液流系统

  光路系统

  光路系统即我们常说的激光器,根据其发射激光波长来分,如常见488nm蓝激光器、635nm的红激光器和405nm的紫激光器,由激光器发出的激光照射到细胞后其产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收。这些光信号包括散射光和荧光信号,FSC(散射光信号,用于量化反应细胞的大小)、SSC(侧向散射光,用于量化反应细胞的复杂程度),这些荧光信号来源于细胞上偶联的荧光素,被激光激发后,会发射荧光信号。

  监测分析系统

  流式细胞仪的检测分析系统就是以通道为单位将细胞的各个通道的光信号汇总分析,zui后得出样品群体中细胞的物理化学特征。

  通道,即光电倍增管,其主要作用为:将光信号转变为电子信号;放大电子信号;分为散射光通道(FSC通道、SSC通道)以及荧光通道。一个激光器可以有多个荧光通道,一个通道可以对应多个荧光染料。

  2.样品细胞:流式细胞术检测的对象一般是细胞,并且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞,如果要检测组织中的细胞,必须先将组织制备成单细胞悬液。

  3.荧光偶联抗体︰样品细胞只有标记荧光素偶联抗体进而被激光照射后才能发射荧光信号,从而得到样品细胞表达某抗原分子强弱等情况。

  了解了流式细胞仪的原理,最最重要的是,对不同专业不同背景的我们来说,流式细胞术,到底能干什么呢?

  01

  流式细胞术可以用来检测细胞表面以及胞内的各种标志,对细胞进行分群鉴定以及各种蛋白表达量高低的比较。比如CD3是T细胞的标志、CD19是B细胞的标志、EpCAM是上皮细胞的标志等。不仅仅是免疫细胞,其他的如肿瘤细胞、成纤维细胞、干细胞等都可以用流式细胞术进行检测。实体组织只要经过处理后制成单细胞悬液也能用流式细胞术进行分析和分选。

  02

  通过标记Ki67、BCL-2、caspases等增殖及凋亡相关基因,流式细胞术可用来检测细胞的增殖以及凋亡。此外还有CFSE、以及PI-annexin V等染料,可用来进行增殖和凋亡分析,在药物对肿瘤影响的研究过程中应用广泛。

  03

  流式细胞术可用来分析细胞周期。细胞核DNA含量随着细胞增殖周期时相的不同而发生变化,用DNA染料进行染色,DNA含量多,荧光信号强,DNA含量少,荧光强度低。通过对细胞瞬间的快速测定,判断细胞所处的细胞周期时相,并分析群体细胞中处于不同周期时相的细胞比例,以研究细胞的周期,DNA复制和染色体倍性等。在肿瘤学研究中尤其常用,可以此来判断药物对肿瘤细胞影响、肿瘤的生长速度与患者预后等。

  04

  流式细胞术可用于疾病诊断中病原微生物的检测,以及环境中饮用水、湖泊、河流、原油中的微生物和海洋微生物检测等。

  05

  流式细胞术还可用于农林畜牧养殖业,如依据DNA含量,用于玉米、向日葵、葡萄等的倍性鉴定,分选X、Y精子以控制家畜性别。

  当然,除了以上最常见的几个反面,还有很多其他的用法,这里小编就不一一列举出来了。


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