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Southern Blot步骤详解和注意事项(southern印迹杂交原理步骤)

发布时间:2022-03-24 10:30:10 阅读:13352次 来源:科研日精进

  Southern Blot 可以检测样品中的 DNA 及其含量,了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

  Southern Blot原理

  将待检测的 DNA 分子用/不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的 DNA 或 RNA 探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。

  试剂和器材

  一、试剂

  变性液:1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH。

  中和液:0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0),1.5mol/L NaCl。

  20×SSC:3mol/L NaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠。

  以上溶液均在 100Kpa 灭菌 20 分钟。

  2×SSC:用无菌移液管吸取 20×SSC 溶液 5mL,加无菌水 45mL。

  6×SSC:用无菌移液管吸取 20×SSC 溶液 15mL,加无菌水 75mL。

  二、器材

  22cm×15cm 瓷盘

  操作方法

  1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离 DNA。取出凝胶,切去边缘多于部分,EB 染色,在紫外灯下照相(放一标尺,可从像片中读出 DNA 迁移的距离)。

  2. 将凝胶置于 200mL 变性液中,浸泡 45 分钟,并温和地不断振荡,使凝胶上的 ds-DNA 转变为 ss-DNA,然后用重蒸水冲洗凝胶几次。

  3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡 45 分钟,将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。

  4. 取一个瓷盘,在底部放一块玻璃板(或一块海绵)使盛器内的 20 倍 SSC 转移滤液低于玻板表面,在玻板表面盖一张 3mm 的二号滤纸,滤纸两边浸没于20倍 SSC 溶液中,在玻璃和滤纸之间,赶掉所有的气泡。

  5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上,赶走两层之间出现的气泡。

  6. 裁剪一张硝酸纤维膜,其长与宽大于凝胶 1—2mm,并在角上作记号,以确定滤膜方位。先把它放在去离子水中润湿后,再放在 20 倍 SSC 溶液中润湿 5 分钟,然后放在凝胶表面,两层之间不可有气泡。

  7. 然后再把两张与滤膜一样大小的二号滤纸,在 2 倍 SSC 溶液中浸湿,覆盖在硝酸纤维膜上,同样要把气泡赶走。

  8. 把一叠吸水纸(或卫生纸,约有 5—8cm 高,略小于滤纸),放置在滤纸上,在吸水纸上再放一块玻璃板和重约 500g 的重物,放置过夜。

  9.转移结束后,移去上面的吸水纸和滤纸,同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜,把凝胶的点样与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。

  11. 把已转移了 DNA 的硝酸纤维膜放在 6 倍 SSC 溶液中振荡浸泡 5 分钟,然后放在滤纸上吸干溶液。再把它夹在两层滤纸之间,80℃真空干燥 2 小时。

  注意事项

  (1)将凝胶中和至中性时,要测 pH, 防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。

  (2)要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/980.html

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